CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
108
agitation à 30 ° C pendant une semaine. Après incubation à 30°C pendant une semaine, les
hydrocarbures résiduels ont été extraits à l'aide d'une technique d'extraction liquide-liquide en
continu en utilisant 10% (V/V) de dichlorométhane (CH 2 Cl 2 , Sigma-Aldrich, Milan, Italie) et
la procédure a été répétée trois fois puis une séparation (phase organique, phase liquide) a été
effectuée à l’aide d’une ampoule à décanter. Les phases organiques ont été combinées et
déshydratées avec du Sulfate de Sodium anhydre (Na 2 S0 4 , Sigma-Aldrich). Les extraits ont
été concentrés par évaporation rotative (Rotavapor modèle R110; Büchi Labortechnik AG,
Flawil, Suisse) à température ambiante. Toutes les mesures ont été effectuées utilisant un
système de chromatographie en phase gazeuse rapide DANI Master GC (DANI Instruments
S.p.A., Milan, Italie) équipé avec injecteur SSL split / splitless et détecteur FID selon la
méthode 3510c de l'agence américaine de protection de l'environnement (EPA 1996; Gentile
et al., 2016). Le pourcentage de biodégradation des souches testées est calculé en incluant les
valeurs résiduelles en GC-FID et le témoin abiotique. Cela correspond au rapport entre la
quantité de substrat dosée par GC-FID dans les essais et le substrat présent dans les témoins
abiotiques à la fin de la période d’incubation et la quantité de substrat initialement introduite
afin de valider l’expérience
IV.12 Test de production de biosurfactants
Les bactéries ayant la capacité de dégrader les hydrocarbures ont la propriété de l’émulsifier
en solution en produisant agents de surface tels que les biosurfactants qui augmentent
l'adhérence des cellules sur le substrat et qui réduisent la tension interfaciale entre les phases
aqueuse et organique ce qui conduit à une biodisponibilité accrue et à la biodégradation des
hydrocarbures (Batista et al., 2006).
IV.12.1
Drop collapse test
Le drop collapse test ou test d’effondrement des gouttes a été réalisé en ajoutant 7 µl de
pétrole brut dans chaque puits d’une plaque de microtitration à 96 puits. Le couvercle a été
équilibré pendant 1 heure à température ambiante, puis 20 µl de culture bactérienne de chaque
isolat ont été ajoutés à la surface du pétrole. Après une minute d'incubation, la forme de la
goutte à la surface du pétrole a été observée. Si la goutte s’effondre, elle indique la présence
de surfactant (résultat positif) ; si elle reste perlée, ceci indique l'absence de surfactant
(réponse négative). Le dodécyl sulfate de sodium (SDS) et l'eau distillée stérile ont été utilisés
comme contrôle positif et négatif, respectivement (Bodour et Miller-Maier 1998; Mahjoubi et
al., 2013).
Matériel & Méthodes
108
agitation à 30 ° C pendant une semaine. Après incubation à 30°C pendant une semaine, les
hydrocarbures résiduels ont été extraits à l'aide d'une technique d'extraction liquide-liquide en
continu en utilisant 10% (V/V) de dichlorométhane (CH 2 Cl 2 , Sigma-Aldrich, Milan, Italie) et
la procédure a été répétée trois fois puis une séparation (phase organique, phase liquide) a été
effectuée à l’aide d’une ampoule à décanter. Les phases organiques ont été combinées et
déshydratées avec du Sulfate de Sodium anhydre (Na 2 S0 4 , Sigma-Aldrich). Les extraits ont
été concentrés par évaporation rotative (Rotavapor modèle R110; Büchi Labortechnik AG,
Flawil, Suisse) à température ambiante. Toutes les mesures ont été effectuées utilisant un
système de chromatographie en phase gazeuse rapide DANI Master GC (DANI Instruments
S.p.A., Milan, Italie) équipé avec injecteur SSL split / splitless et détecteur FID selon la
méthode 3510c de l'agence américaine de protection de l'environnement (EPA 1996; Gentile
et al., 2016). Le pourcentage de biodégradation des souches testées est calculé en incluant les
valeurs résiduelles en GC-FID et le témoin abiotique. Cela correspond au rapport entre la
quantité de substrat dosée par GC-FID dans les essais et le substrat présent dans les témoins
abiotiques à la fin de la période d’incubation et la quantité de substrat initialement introduite
afin de valider l’expérience
IV.12 Test de production de biosurfactants
Les bactéries ayant la capacité de dégrader les hydrocarbures ont la propriété de l’émulsifier
en solution en produisant agents de surface tels que les biosurfactants qui augmentent
l'adhérence des cellules sur le substrat et qui réduisent la tension interfaciale entre les phases
aqueuse et organique ce qui conduit à une biodisponibilité accrue et à la biodégradation des
hydrocarbures (Batista et al., 2006).
IV.12.1
Drop collapse test
Le drop collapse test ou test d’effondrement des gouttes a été réalisé en ajoutant 7 µl de
pétrole brut dans chaque puits d’une plaque de microtitration à 96 puits. Le couvercle a été
équilibré pendant 1 heure à température ambiante, puis 20 µl de culture bactérienne de chaque
isolat ont été ajoutés à la surface du pétrole. Après une minute d'incubation, la forme de la
goutte à la surface du pétrole a été observée. Si la goutte s’effondre, elle indique la présence
de surfactant (résultat positif) ; si elle reste perlée, ceci indique l'absence de surfactant
(réponse négative). Le dodécyl sulfate de sodium (SDS) et l'eau distillée stérile ont été utilisés
comme contrôle positif et négatif, respectivement (Bodour et Miller-Maier 1998; Mahjoubi et
al., 2013).