CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
107
IV.10.2.2
xylA
CCAGGTGGAATTTTCAGTGGTTGG‘3)
et
xylA-R
(5’AATTAACTCGAAGCGCCCACCCCA- ‘3) dans un volume réactionnel final de 30 µl
contenant 1 µl d'ADN, 6 µl de chaque amorce (10 µM), 0,6 µl de desoxyribonucleoside
triphosphate (dNTPs 0,2 mM) (Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 0,5 U de Taq
polymerase (Qiagen, Milano, Italie) avec son tampon réactionnel 1X final. La taille
d'amplicon attendue est d'environ 291 bp. Les amplicons obtenus ont été visualisés sur un gel
d'agarose à 1%.
La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Gradient,Eppendorf) en utilisant
le programme de cycles suivant:
Tableau 17. Programme PCR pour l’amplification du gène xylA
Température
temps
Nombre de cycle
Dénaturation initiale
94°C
30 Sec
1 cycle
Dénaturation
94°C
30 Sec
35 cycles
Hybridation
64°C
1 min
Elongation
68°C
2 min
Elongation finale
68°C
5 min
1 cycle
ADN
4°C
-
IV.11 Test de biodégradation des souches sélectionnées.
La capacité de dégradation des souches sélectionnées a été évaluée dans le milieu de culture
ONR7a additionné de pétrole brut. Les cultures de départ ont été préparées en inoculant une
seule colonie dans du milieu ONR7a additionné d'hexadécane stérile à 1% (v/v) comme seule
source de carbone. Après une semaine d'incubation à 30 ± 1 °C avec agitation, les cultures ont
été centrifugées à 9 000 x g pendant 10 minutes. Le culot a ensuite été remis en suspension
dans un milieu stérile (ONR7a) pour obtenir une densité optique (600 nm) de 0,1. La
suspension obtenue est par la suite utilisée comme inoculum pour l'expérience de
biodégradation.
En utilisant des flacons de 100 ml, on a inoculé 1 ml de chaque suspension dans 30 ml
d'ONR7a supplémenté avec 30 µl de pétrole brut stérilisé par filtration. Un flacon sans aucun
inoculum a été utilisé comme contrôle abiotique. Tous les flacons ont été incubés avec
Matériel & Méthodes
107
IV.10.2.2
xylA
CCAGGTGGAATTTTCAGTGGTTGG‘3)
et
xylA-R
(5’AATTAACTCGAAGCGCCCACCCCA- ‘3) dans un volume réactionnel final de 30 µl
contenant 1 µl d'ADN, 6 µl de chaque amorce (10 µM), 0,6 µl de desoxyribonucleoside
triphosphate (dNTPs 0,2 mM) (Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 0,5 U de Taq
polymerase (Qiagen, Milano, Italie) avec son tampon réactionnel 1X final. La taille
d'amplicon attendue est d'environ 291 bp. Les amplicons obtenus ont été visualisés sur un gel
d'agarose à 1%.
La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Gradient,Eppendorf) en utilisant
le programme de cycles suivant:
Tableau 17. Programme PCR pour l’amplification du gène xylA
Température
temps
Nombre de cycle
Dénaturation initiale
94°C
30 Sec
1 cycle
Dénaturation
94°C
30 Sec
35 cycles
Hybridation
64°C
1 min
Elongation
68°C
2 min
Elongation finale
68°C
5 min
1 cycle
ADN
4°C
-
IV.11 Test de biodégradation des souches sélectionnées.
La capacité de dégradation des souches sélectionnées a été évaluée dans le milieu de culture
ONR7a additionné de pétrole brut. Les cultures de départ ont été préparées en inoculant une
seule colonie dans du milieu ONR7a additionné d'hexadécane stérile à 1% (v/v) comme seule
source de carbone. Après une semaine d'incubation à 30 ± 1 °C avec agitation, les cultures ont
été centrifugées à 9 000 x g pendant 10 minutes. Le culot a ensuite été remis en suspension
dans un milieu stérile (ONR7a) pour obtenir une densité optique (600 nm) de 0,1. La
suspension obtenue est par la suite utilisée comme inoculum pour l'expérience de
biodégradation.
En utilisant des flacons de 100 ml, on a inoculé 1 ml de chaque suspension dans 30 ml
d'ONR7a supplémenté avec 30 µl de pétrole brut stérilisé par filtration. Un flacon sans aucun
inoculum a été utilisé comme contrôle abiotique. Tous les flacons ont été incubés avec