CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
106
IV.10.2
Gènes responsables de la dégradation des hydrocarbures monoaromatiques.
L’attaque oxydative initiale des BTEX convertissant le composé en une structure de catéchol
et le clivage de la structure du catéchol sont des étapes clés dans la dégradation aérobie des
BTEX. L’attaque oxydative initiale consiste en une oxydation directe du noyau aromatique
via une mono-oxygénase (Kahng et al., 2001) ou un attaque via une dioxygénase (Zylstra et
Gibson, 1989; Furukawa et al., 1993) ou l'oxydation de la chaîne latérale alkyle qui est
catalysée par des mono-oxygénases (Burlage et al., 1989).
Une amplification par PCR des fragments de gènes de monooxygénase a été réalisée. Le
fragment du composant hydroxylase terminal de la xylène monooxygénase codée par le gène
xylM et le composant de transfert d'électrons de la xylène monooxygénase codée par le gène
xylA ont été amplifiés en utilisant les couples d'amorces TOL-F / TOL-R (Baldwin et al.,
2003) et XYLA-F / XYLA-R (Hendrickx et al. 2006) respectivement.
IV.10.2.1
XylM
L’amplification a été réalisée en utilisant le couple d’amorces TOL-F (5’TGAGGCTGAAACTTTACGTAGA- ‘3) et TOL-R (5’- CTCACCTGGAGTTGCGTAC‘3) (Kloos et al., 2006) dans un volume réactionnel final de 30 µl contenant 1 µl d'ADN, 6 µl
de chaque amorce (10 µM), 0,6 µl de desoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs 0,2 mM)
(Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 0,5 U de Taq polymerase (Qiagen, Milano, Italie)
avec son tampon réactionnel 1X final. La taille d'amplicon attendue est d'environ 475 bp. Les
amplicons obtenus ont été visualisés sur un gel d'agarose à 1%.
La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Gradient,Eppendorf) en utilisant
le programme de cycles suivant:
Tableau 16. Programme PCR pour l’amplification du gène xylM
Température
temps
Nombre de cycle
Dénaturation initiale
94°C
30 Sec
1 cycle
Dénaturation
94°C
30 Sec
35 cycles
Hybridation
55°C
1 min
Elongation
68°C
2 min
Elongation finale
68°C
5 min
1 cycle
Matériel & Méthodes
106
IV.10.2
Gènes responsables de la dégradation des hydrocarbures monoaromatiques.
L’attaque oxydative initiale des BTEX convertissant le composé en une structure de catéchol
et le clivage de la structure du catéchol sont des étapes clés dans la dégradation aérobie des
BTEX. L’attaque oxydative initiale consiste en une oxydation directe du noyau aromatique
via une mono-oxygénase (Kahng et al., 2001) ou un attaque via une dioxygénase (Zylstra et
Gibson, 1989; Furukawa et al., 1993) ou l'oxydation de la chaîne latérale alkyle qui est
catalysée par des mono-oxygénases (Burlage et al., 1989).
Une amplification par PCR des fragments de gènes de monooxygénase a été réalisée. Le
fragment du composant hydroxylase terminal de la xylène monooxygénase codée par le gène
xylM et le composant de transfert d'électrons de la xylène monooxygénase codée par le gène
xylA ont été amplifiés en utilisant les couples d'amorces TOL-F / TOL-R (Baldwin et al.,
2003) et XYLA-F / XYLA-R (Hendrickx et al. 2006) respectivement.
IV.10.2.1
XylM
L’amplification a été réalisée en utilisant le couple d’amorces TOL-F (5’TGAGGCTGAAACTTTACGTAGA- ‘3) et TOL-R (5’- CTCACCTGGAGTTGCGTAC‘3) (Kloos et al., 2006) dans un volume réactionnel final de 30 µl contenant 1 µl d'ADN, 6 µl
de chaque amorce (10 µM), 0,6 µl de desoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs 0,2 mM)
(Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 0,5 U de Taq polymerase (Qiagen, Milano, Italie)
avec son tampon réactionnel 1X final. La taille d'amplicon attendue est d'environ 475 bp. Les
amplicons obtenus ont été visualisés sur un gel d'agarose à 1%.
La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Gradient,Eppendorf) en utilisant
le programme de cycles suivant:
Tableau 16. Programme PCR pour l’amplification du gène xylM
Température
temps
Nombre de cycle
Dénaturation initiale
94°C
30 Sec
1 cycle
Dénaturation
94°C
30 Sec
35 cycles
Hybridation
55°C
1 min
Elongation
68°C
2 min
Elongation finale
68°C
5 min
1 cycle