CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes

 

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génomique des souches bactérienne étudiées (Colonie PCR comme décrit précédemment).
Afin de détecter les gènes cataboliques impliqués dans les voies de biodégradation des
hydrocarbures, une amplification par PCR des fragments de gènes de monooxygénase a été
réalisée.
IV.10.1
Gènes responsables de la dégradation des hydrocarbures aliphatiques.
IV.10.1.1
alkB

 
Les alcanes monooxygénases constituent un groupe d’enzymes qui catalysent la première
étape de la dégradation aérobie des alcanes. La génétique de ces enzymes est bien
caractérisée, en particulier chez Pseudomonas (Van Beilen. Et al., 2001; Hasanshahian et al.,
2008) et Rhodococcus (Van Beilen et al., 2006). Habituellement, l’alcane monooxygénase
initie la dégradation des n-alcanes par l’incorporation d’un atome d’oxygène au carbone
terminal ou subterminal. Les intermédiaires sont ensuite transformés en leurs acides
correspondants avant d'entrer dans la voie de la b-oxydation (Rojo 2009).
Un fragment du gène de l'alcane monooxygénase alkB a été amplifié par PCR.
AAYACNGCNCAYGARCTNGGNCAYAA‘3)
et
alkB-1r
(5’GCRTGRTGRTCNGARTGNCGYTG- ‘3) Avec C+T=Y (Kloos et al., 2006) dans un volume
réactionnel final de 30 µl contenant 2 µl d'ADN, 1,5 µl de chaque amorce (0,5 µM), 0,6 µl
de desoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs 0,2 mM) (Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad,
CA), 0,6 µl de Phire Hot Start II DNA Polymerase (Thermo Scientific) avec son tampon
réactionnel 1X final. La taille d'amplicon attendue est d'environ 550 bp. Les amplicons
obtenus ont été visualisés sur un gel d'agarose à 1%.
La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Gradient,Eppendorf) en utilisant
le programme de cycles suivant:
Tableau 15. Programme PCR pour l’amplification du gène alkB
Température
temps
Nombre de cycle
Dénaturation initiale
98°C
30 Sec
1 cycle
Dénaturation
98°C
15 Sec
35 cycles
Hybridation
55°C
15 Sec
Elongation
72°C
10 sec
Elongation finale
72°C
1 min
1 cycle