CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
104
des séquences connues (Altschul et al., 1990). Les séquences d'ARNr 16S issues de cette
étude ont été déposées dans Genbank sous les numéros d'accès de MH425630 à MH425652.
IV.9.6 Analyse phylogénétique.
La PCR universelle ciblant le gène codant pour l’ARNr 16S à l’aide d’amorces universelles, a
d’abord été développée pour des études phylogénétiques. En effet ce gène est universellement
retrouvé chez les bactéries et sa fonction est conservée. Ainsi, il peut servir d’« horloge
moléculaire » pour mesurer les distances phylogénétiques entre les différentes espèces
bactériennes (Renvoisé, 2011).
Les séquences 16S obtenues dans cette étude ont été utilisées pour rechercher les séquences
les plus proches dans la banque de séquences genbank grâce au programme BLAST. Pour
chaque séquence, la séquence la plus proche a été conservée et les séquences de ce travail et
les séquences les plus proches de Genbank ont été utilisée pour réaliser un arbre
phylogénétique
à
l’aide
du
programme
Clustal
Omega
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) développé par l’EMBL (Sievers et al., 2011).
Pour ce faire, toutes les séquences ont été alignées et seules les parties communes ont été
gardées. Les séquences sont comparées deux à deux et la distance génétique est calculée.
Distance= 1-similarité
Similarité=% d’identité entre les séquences. Le logiciel tient aussi compte des insertions et
des délétions éventuelles. La matrice de distance générée permet de crée un dendrogramme
basé sur la méthode UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetic mean).
IV.10 Détection et amplification des gènes de dégradation en utilisant des amorces
spécifiques par PCR.
Dans une optique de bioremédiation, l’analyse fonctionnelle des microflores et donc des
gènes intervenant dans les processus de dégradation, est un paramètre clé. L’étude des
fonctions métaboliques chez les bactéries est souvent appréhendée par la recherche de gènes
connus impliqués ou associés à des mécanismes de dégradation. Ces techniques de screening
impliquent l’utilisation d’amorces pour l’utilisation en PCR ou de sondes pour les
hybridations qui sont dessinées à partir d’éléments génétiques de souches isolées.
Ainsi, les amorces ou les sondes utilisées sont plus ou moins dégénérées de manière à cibler
une diversité plus ou moins importante (M’rassi, 2014).
Dans cette étude, grâce à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), des gènes d’intérêts
(également appelés biomarqueurs) ont été spécifiquement amplifiés à partir de l’ADN
Matériel & Méthodes
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des séquences connues (Altschul et al., 1990). Les séquences d'ARNr 16S issues de cette
étude ont été déposées dans Genbank sous les numéros d'accès de MH425630 à MH425652.
IV.9.6 Analyse phylogénétique.
La PCR universelle ciblant le gène codant pour l’ARNr 16S à l’aide d’amorces universelles, a
d’abord été développée pour des études phylogénétiques. En effet ce gène est universellement
retrouvé chez les bactéries et sa fonction est conservée. Ainsi, il peut servir d’« horloge
moléculaire » pour mesurer les distances phylogénétiques entre les différentes espèces
bactériennes (Renvoisé, 2011).
Les séquences 16S obtenues dans cette étude ont été utilisées pour rechercher les séquences
les plus proches dans la banque de séquences genbank grâce au programme BLAST. Pour
chaque séquence, la séquence la plus proche a été conservée et les séquences de ce travail et
les séquences les plus proches de Genbank ont été utilisée pour réaliser un arbre
phylogénétique
à
l’aide
du
programme
Clustal
Omega
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) développé par l’EMBL (Sievers et al., 2011).
Pour ce faire, toutes les séquences ont été alignées et seules les parties communes ont été
gardées. Les séquences sont comparées deux à deux et la distance génétique est calculée.
Distance= 1-similarité
Similarité=% d’identité entre les séquences. Le logiciel tient aussi compte des insertions et
des délétions éventuelles. La matrice de distance générée permet de crée un dendrogramme
basé sur la méthode UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetic mean).
IV.10 Détection et amplification des gènes de dégradation en utilisant des amorces
spécifiques par PCR.
Dans une optique de bioremédiation, l’analyse fonctionnelle des microflores et donc des
gènes intervenant dans les processus de dégradation, est un paramètre clé. L’étude des
fonctions métaboliques chez les bactéries est souvent appréhendée par la recherche de gènes
connus impliqués ou associés à des mécanismes de dégradation. Ces techniques de screening
impliquent l’utilisation d’amorces pour l’utilisation en PCR ou de sondes pour les
hybridations qui sont dessinées à partir d’éléments génétiques de souches isolées.
Ainsi, les amorces ou les sondes utilisées sont plus ou moins dégénérées de manière à cibler
une diversité plus ou moins importante (M’rassi, 2014).
Dans cette étude, grâce à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), des gènes d’intérêts
(également appelés biomarqueurs) ont été spécifiquement amplifiés à partir de l’ADN