CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
103
IV.9.3 Electrophorèse sur gel d’agarose.
Cette technique est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous
l’effet d’un champ électrique. Après la digestion, on fait migrer nos échantillons par
électrophorèse dans un gel d’agarose (1%) afin de séparer la séquence d'intérêt du vecteur et
aussi pour contrôler les poids moléculaires. Les plus petites molécules se déplacent plus vite
et migreront donc plus loin. La migration peut être suivi grâce à du bleu de dépôt. On utilise
des marqueurs de taille pour pouvoir déterminer la taille (en bp) des acides nucléiques. Les
fragments d'ADN sont visibles sous UV grâce à la présence de bromure d'Ethidium dans le
gel. La taille d'amplicon attendue est d'environ 1450 bp.
Pour préparer l'ADN à charger, on mélange de l'eau (4 µl), puis le tampon de charge (1 µl) et
en dernier l’échantillon (1 µl). Les mélanges sont ensuite chargés dans les puits du gel. Le gel
est placé dans un lit rempli de TAE (1x) et d’une intensité de courant de 100 V. Après
migration, le gel est pris et est placé sur un trans illuminateur connecté avec un appareil photo
et un ordinateur qui permet de capturer l'image.
IV.9.4 Purification des produits PCR.
Les produits PCR en solution ont été purifiés à l’aide du kit commercial NucleoSpin® Gel et
PCR Clean-Up (Macherey-Nagel) (figure 38). Cette purification a pour but de séparer les
fragments d’ADN amplifiés du milieu réactionnel de PCR (protéines, sels) ainsi que des
autres acides nucléiques (Figure 39). La qualité et la taille des produits de PCR purifiés ont
été vérifiées par électrophorèse.
Figure 39. Schéma de la procédure de purification des produits PCR
IV.9.5 Séquençage.
Les fragments d'ADNr 16S amplifiés ont été séquencés par le biais de Macrogen Europe
Service (Amsterdam, Pays-Bas). Les séquences ont été comparées avec celles présentes dans
la banque de données GenBank database du National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) grâce à l’outil d’alignement Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST). Cette étape permet l’identification de la séquence par homologie avec
Matériel & Méthodes
103
IV.9.3 Electrophorèse sur gel d’agarose.
Cette technique est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous
l’effet d’un champ électrique. Après la digestion, on fait migrer nos échantillons par
électrophorèse dans un gel d’agarose (1%) afin de séparer la séquence d'intérêt du vecteur et
aussi pour contrôler les poids moléculaires. Les plus petites molécules se déplacent plus vite
et migreront donc plus loin. La migration peut être suivi grâce à du bleu de dépôt. On utilise
des marqueurs de taille pour pouvoir déterminer la taille (en bp) des acides nucléiques. Les
fragments d'ADN sont visibles sous UV grâce à la présence de bromure d'Ethidium dans le
gel. La taille d'amplicon attendue est d'environ 1450 bp.
Pour préparer l'ADN à charger, on mélange de l'eau (4 µl), puis le tampon de charge (1 µl) et
en dernier l’échantillon (1 µl). Les mélanges sont ensuite chargés dans les puits du gel. Le gel
est placé dans un lit rempli de TAE (1x) et d’une intensité de courant de 100 V. Après
migration, le gel est pris et est placé sur un trans illuminateur connecté avec un appareil photo
et un ordinateur qui permet de capturer l'image.
IV.9.4 Purification des produits PCR.
Les produits PCR en solution ont été purifiés à l’aide du kit commercial NucleoSpin® Gel et
PCR Clean-Up (Macherey-Nagel) (figure 38). Cette purification a pour but de séparer les
fragments d’ADN amplifiés du milieu réactionnel de PCR (protéines, sels) ainsi que des
autres acides nucléiques (Figure 39). La qualité et la taille des produits de PCR purifiés ont
été vérifiées par électrophorèse.
Figure 39. Schéma de la procédure de purification des produits PCR
IV.9.5 Séquençage.
Les fragments d'ADNr 16S amplifiés ont été séquencés par le biais de Macrogen Europe
Service (Amsterdam, Pays-Bas). Les séquences ont été comparées avec celles présentes dans
la banque de données GenBank database du National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) grâce à l’outil d’alignement Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST). Cette étape permet l’identification de la séquence par homologie avec