CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes

 

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tube, tandis que l’ADN est obtenu sous forme de surnageant.
L'amplification PCR du gène de l'ARNr 16S a été réalisée en utilisant le couple d’amorce
Bac27_F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) et de l'amorce inverse universelle
Uni_1492R (5’-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3’) (figure 38) (Lane, 1991 ; Frank et al.,
2008).
Figure 38. Représentation schématique du gène codant pour l’ARN 16S. La position des
amorces est indiquée. V1 à V9= régions variables. 1 à 1500 : taille du gène en paires de bases
(modifié de Yang et al., 2016)
La réaction d'amplification a été réalisée dans un volume réactionnel final de 30 µl contenant
1 µl d'ADN (entre 10 et 100 ng), 0,6 µl de chaque amorce (0,2 µM), 0,6 µl de
desoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs 0,2 mM) (Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, CA),
0,5 U de Taq polymerase (Qiagen, Milano, Italie) avec son tampon réactionnel 1× final.
La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Gradient,Eppendorf) en utilisant
le programme de cycles suivant:
Tableau 14. Programme PCR pour l’amplification du gène ADNr 16 S
Etapes
Température
Durée
Nombre de cycle
Dénaturation initiale
94°C
30 Sec
1 cycle
Dénaturation
94°C
30 Sec
30 cycles
Hybridation
50°C
1 min
Elongation
68°C
1 min 30 sec
Elongation finale
68°C
5 min
1 cycle
ADN
4°C
-