CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
101
IV.9 Caractérisations moléculaires des bactéries isolées.
IV.9.1 Analyse taxonomique des gènes d’ARNr 16S et séquençage.
L’identification bactérienne se fait traditionnellement à partir des caractères phénotypiques de
la bactérie: coloration (Gram), morphologie, aptitude à croitre sur certains milieux de culture,
caractères biochimiques détectés par diverses techniques commerciales (galeries API, …).
Toutefois certaines bactéries sont mal identifiées phénotypiquement car elles sont
difficilement cultivables voir non cultivables du tout. En effet, certaines bactéries expriment
peu de caractères phénotypiques. Pour d’autres espèces, une situation de stress peut altérer les
caractères phénotypiques. Une identification basée exclusivement sur des caractères
phénotypiques peut donc mener à un résultat erroné. Par ailleurs, les bactéries rares ne sont
pas répertoriées dans les bases de données des systèmes commercialisés et en conséquence,
les études basées sur les caractères phénotypiques ne permettront pas de les identifier. Enfin,
pour certaines bactéries à croissance difficile les caractères phénotypiques sont difficiles à
déceler ; la biologie moléculaire simplifie dans ce cas l’identification (Petti et al., 2005 ;
Renvoisé, 2011). Dans ces situations, l’amplification et le séquençage du gène codant pout
l’ARNr 16S suivi de la comparaison de la séquence obtenue à des bases de données ont
démontré leur efficacité pour l’identification bactérienne. Il s’agit d’une méthode universelle,
précise et objective, dont la variabilité inter opérateur est limitée par rapport aux techniques
conventionnelles. Pour différentier certains genres ou pour décrire une nouvelle espèce,
l’amplification « 16S » reste nécessaire (Clarridge, 2004).
IV.9.2 Amplification des gènes d’ADNr 16 S par PCR.
La réaction de polymérisation en chaine (PCR) consiste à multiplier la séquence du gène de
l’ADNr 16S à l’aide d’amorces spécifiques encadrant la séquence de ce gène et générant un
amplicon de 1500 bp (Ennadir et al., 2014).
La caractérisation moléculaire des isolats a été basée sur l'analyse de la séquence du gène de
l'ARN ribosomal 16S (ARNr). L'ADN bactérien a été extrait en suivant la méthode de
« Colonie PCR » (China et al., 1996). C’est une méthode basée sur le choc thermique, Des
colonies isolées purifiées sont prélevées sous une hotte à flux laminaire vertical et immergées
dans 25 µl de TE dans des microtubes de 1,5 ml. Les tubes sont ensuite immergés dans de
l'eau bouillante avec un flotteur pendant cinq minutes, puis mis sur de la glace pendant 5
minutes supplémentaires puis centrifugés pendant 5 minutes à 13 000 g. Au cours de ce
processus, un culot contenant des protéines et des fragments de cellules est formé au fond du
Matériel & Méthodes
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IV.9 Caractérisations moléculaires des bactéries isolées.
IV.9.1 Analyse taxonomique des gènes d’ARNr 16S et séquençage.
L’identification bactérienne se fait traditionnellement à partir des caractères phénotypiques de
la bactérie: coloration (Gram), morphologie, aptitude à croitre sur certains milieux de culture,
caractères biochimiques détectés par diverses techniques commerciales (galeries API, …).
Toutefois certaines bactéries sont mal identifiées phénotypiquement car elles sont
difficilement cultivables voir non cultivables du tout. En effet, certaines bactéries expriment
peu de caractères phénotypiques. Pour d’autres espèces, une situation de stress peut altérer les
caractères phénotypiques. Une identification basée exclusivement sur des caractères
phénotypiques peut donc mener à un résultat erroné. Par ailleurs, les bactéries rares ne sont
pas répertoriées dans les bases de données des systèmes commercialisés et en conséquence,
les études basées sur les caractères phénotypiques ne permettront pas de les identifier. Enfin,
pour certaines bactéries à croissance difficile les caractères phénotypiques sont difficiles à
déceler ; la biologie moléculaire simplifie dans ce cas l’identification (Petti et al., 2005 ;
Renvoisé, 2011). Dans ces situations, l’amplification et le séquençage du gène codant pout
l’ARNr 16S suivi de la comparaison de la séquence obtenue à des bases de données ont
démontré leur efficacité pour l’identification bactérienne. Il s’agit d’une méthode universelle,
précise et objective, dont la variabilité inter opérateur est limitée par rapport aux techniques
conventionnelles. Pour différentier certains genres ou pour décrire une nouvelle espèce,
l’amplification « 16S » reste nécessaire (Clarridge, 2004).
IV.9.2 Amplification des gènes d’ADNr 16 S par PCR.
La réaction de polymérisation en chaine (PCR) consiste à multiplier la séquence du gène de
l’ADNr 16S à l’aide d’amorces spécifiques encadrant la séquence de ce gène et générant un
amplicon de 1500 bp (Ennadir et al., 2014).
La caractérisation moléculaire des isolats a été basée sur l'analyse de la séquence du gène de
l'ARN ribosomal 16S (ARNr). L'ADN bactérien a été extrait en suivant la méthode de
« Colonie PCR » (China et al., 1996). C’est une méthode basée sur le choc thermique, Des
colonies isolées purifiées sont prélevées sous une hotte à flux laminaire vertical et immergées
dans 25 µl de TE dans des microtubes de 1,5 ml. Les tubes sont ensuite immergés dans de
l'eau bouillante avec un flotteur pendant cinq minutes, puis mis sur de la glace pendant 5
minutes supplémentaires puis centrifugés pendant 5 minutes à 13 000 g. Au cours de ce
processus, un culot contenant des protéines et des fragments de cellules est formé au fond du