CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
98
Les isolats purifiés ont ensuite été conservés en ajoutant du glycérol préalablement stérilisé à
la suspension bactérienne (1:1, v/v). Le mélange est agité au vortex et conservé à -20 ° C.
IV.5.2 Criblage des souches bactériennes isolées.
Les bactéries purifiées obtenues à partir des boites de pétri, ont fait l’objet d’un criblage pour
confirmer leur capacité à dégrader les hydrocarbures et à les utiliser comme source de carbone
et d’énergie. Ceci a été réalisé par la cultivation de chaque isolat dans le milieu ONR7a
additionné de pétrole brut (1%, v/v) comme unique source de carbone et d’énergie. Les
cultures ont été incubées à 30°C avec agitation (180 rpm). La consommation des
hydrocarbures est indiquée par la variation de la turbidité. La densité optique (600 nm) de la
culture a été mesurée après une semaine d’incubation. Les isolats manifestant une croissance
prononcée sur le pétrole brut ont été sélectionnés pour des caractérisations plus poussées.
IV.6 Test de croissance sur différentes sources d’hydrocarbures et cinétiques de
croissance.
Les bactéries isolées ont été caractérisées en fonction des différents hydrocarbures qu’elles
sont capables de métaboliser.
Pour déterminer le pouvoir d’utilisation des différents hydrocarbures (individuellement)
comme uniques sources de carbone par les souches bactériennes, chaque souche a été
inoculée dans des tubes stériles contenant du milieu liquide ONR7a additionné
respectivement de 1% (v/v) de pétrole brut, n-hexadécane (C 16 ), n-Hexacosane (C 26 ), noctacosane (C 28 ), benzène, toluène et xylène comme seule source de carbone et d’énergie. En
tant que contrôle, un milieu sans hydrocarbures a été utilisé et un contrôle a été établi pour
chaque essai. La croissance a été évaluée après une semaine d'incubation à 30 ± 1 ° C en
mesurant la turbidité (DO à 600 nm) à l'aide d'un spectrophotomètre.
Parallèlement, des courbes de croissance ont été réalisées afin de suivre l’évolution des
souches sélectionnées dans le milieu liquide additionné cette fois ci de pétrole brut comme
unique source de carbone et d’énergie.
Dans des Erlen-Meyer stériles, contenant 90 ml d’ONR7a, on ensemence 1 ml de suspension
bactérienne préparée à partir d’une culture pure de la bactérie sélectionnée puis on ajoute 1 ml
d’hydrocarbures comme seule source de carbone et d’énergie. Le tout est incubé à 30°C avec
agitation. Des mesures quotidiennes de la densité optique (DO), ont été réalisées par
spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm.
Matériel & Méthodes
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Les isolats purifiés ont ensuite été conservés en ajoutant du glycérol préalablement stérilisé à
la suspension bactérienne (1:1, v/v). Le mélange est agité au vortex et conservé à -20 ° C.
IV.5.2 Criblage des souches bactériennes isolées.
Les bactéries purifiées obtenues à partir des boites de pétri, ont fait l’objet d’un criblage pour
confirmer leur capacité à dégrader les hydrocarbures et à les utiliser comme source de carbone
et d’énergie. Ceci a été réalisé par la cultivation de chaque isolat dans le milieu ONR7a
additionné de pétrole brut (1%, v/v) comme unique source de carbone et d’énergie. Les
cultures ont été incubées à 30°C avec agitation (180 rpm). La consommation des
hydrocarbures est indiquée par la variation de la turbidité. La densité optique (600 nm) de la
culture a été mesurée après une semaine d’incubation. Les isolats manifestant une croissance
prononcée sur le pétrole brut ont été sélectionnés pour des caractérisations plus poussées.
IV.6 Test de croissance sur différentes sources d’hydrocarbures et cinétiques de
croissance.
Les bactéries isolées ont été caractérisées en fonction des différents hydrocarbures qu’elles
sont capables de métaboliser.
Pour déterminer le pouvoir d’utilisation des différents hydrocarbures (individuellement)
comme uniques sources de carbone par les souches bactériennes, chaque souche a été
inoculée dans des tubes stériles contenant du milieu liquide ONR7a additionné
respectivement de 1% (v/v) de pétrole brut, n-hexadécane (C 16 ), n-Hexacosane (C 26 ), noctacosane (C 28 ), benzène, toluène et xylène comme seule source de carbone et d’énergie. En
tant que contrôle, un milieu sans hydrocarbures a été utilisé et un contrôle a été établi pour
chaque essai. La croissance a été évaluée après une semaine d'incubation à 30 ± 1 ° C en
mesurant la turbidité (DO à 600 nm) à l'aide d'un spectrophotomètre.
Parallèlement, des courbes de croissance ont été réalisées afin de suivre l’évolution des
souches sélectionnées dans le milieu liquide additionné cette fois ci de pétrole brut comme
unique source de carbone et d’énergie.
Dans des Erlen-Meyer stériles, contenant 90 ml d’ONR7a, on ensemence 1 ml de suspension
bactérienne préparée à partir d’une culture pure de la bactérie sélectionnée puis on ajoute 1 ml
d’hydrocarbures comme seule source de carbone et d’énergie. Le tout est incubé à 30°C avec
agitation. Des mesures quotidiennes de la densité optique (DO), ont été réalisées par
spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm.