CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
97
Indice de Jaccard J= í µí±11 í µí±11 + í µí±10 + í µí±01
M11 : bandes présente dans les deux échantillons
M10 : bandes présentes dans l’échantillon 1 et pas dans l’échantillon 2
M01 : bandes présentes dans l’échantillon 2 et pas dans l’échantillon 1
Certaines bandes DGGE dominantes ont été excisées avec un embout de pipette stérile et
remises en suspension toute la nuit dans 20 µl d’eau dénaturée ADN / ARN free (GIBCO) à 4
° C, puis congelées à -20 ° C (Catania et al., 2015)
IV.5 Isolement et caractérisation des bactéries marines dégradant les hydrocarbures.
IV.5.1 Enrichissement et isolement de bactéries aérobies dégradant les hydrocarbures.
Des cultures d'enrichissement ont été mises en place afin d’isoler les bactéries autochtones
ayant la capacité de dégrader les hydrocarbures et d’étudier leur potentiel de dégradation.
Ceci a été réalisé en inoculant les échantillons de sédiments et d’eau de mer dans le milieu
ONR7a additionné d’hydrocarbures comme unique source de carbone et d’énergie. ONR7a
est un milieu synthétique dont la composition imite celle de l’eau de mer mais qui manque, à
lui seul, d’une source principale de carbone (Dyksterhouse et al., 1995). La composition
détaillée de ce milieu ainsi que la méthode de préparation sont décrites dans l’annexe 2.
Des aliquotes de sédiments (1 g) ou d'eau de mer (1 ml) ont été inoculés dans des erlenmeyers
contenant 100 ml d’ONR7a additionnés respectivement de 0,1% (v/v) de pétrole brut, d’un
mélange de n-alcanes (C 14 + C 16 + C 18 , 1: 1: 1) ou d’un mélange de benzène /toluène/xylène
(pures) (1:1:1) comme uniques sources de carbone et d’énergie. Des témoins contenant les
mêmes quantités de milieu et d’hydrocarbures mais sans échantillons ont été également
préparés. Tous les flacons ont été incubés pendant 10 jours à 30 ° C sous agitation (180
tr/min) (Hassanshahian et al., 2012).
Ensuite, des aliquotes ont été prélevées et placées dans du milieu frais contenant la même
concentration d'hydrocarbures et incubées dans les mêmes conditions et des dilutions ont été
préparées. Un volume (100 µl) de chaque dilution est étalé sur la surface des boites de pétri
contenant du milieu ONR7a solide (ONR7a Agar) avec les mêmes hydrocarbures imbibant un
papier filtre stérile placé sur le couvercle de la boîte. Les boites ont été incubées à 30 ° C.
Des colonies phénotypiquement différentes obtenues à partir des boites ont fait l’objet de
purification par repiquages successives sur milieu ONR7a Agar, jusqu’à l’obtention de
colonies pures.
Matériel & Méthodes
97
Indice de Jaccard J= í µí±11 í µí±11 + í µí±10 + í µí±01
M11 : bandes présente dans les deux échantillons
M10 : bandes présentes dans l’échantillon 1 et pas dans l’échantillon 2
M01 : bandes présentes dans l’échantillon 2 et pas dans l’échantillon 1
Certaines bandes DGGE dominantes ont été excisées avec un embout de pipette stérile et
remises en suspension toute la nuit dans 20 µl d’eau dénaturée ADN / ARN free (GIBCO) à 4
° C, puis congelées à -20 ° C (Catania et al., 2015)
IV.5 Isolement et caractérisation des bactéries marines dégradant les hydrocarbures.
IV.5.1 Enrichissement et isolement de bactéries aérobies dégradant les hydrocarbures.
Des cultures d'enrichissement ont été mises en place afin d’isoler les bactéries autochtones
ayant la capacité de dégrader les hydrocarbures et d’étudier leur potentiel de dégradation.
Ceci a été réalisé en inoculant les échantillons de sédiments et d’eau de mer dans le milieu
ONR7a additionné d’hydrocarbures comme unique source de carbone et d’énergie. ONR7a
est un milieu synthétique dont la composition imite celle de l’eau de mer mais qui manque, à
lui seul, d’une source principale de carbone (Dyksterhouse et al., 1995). La composition
détaillée de ce milieu ainsi que la méthode de préparation sont décrites dans l’annexe 2.
Des aliquotes de sédiments (1 g) ou d'eau de mer (1 ml) ont été inoculés dans des erlenmeyers
contenant 100 ml d’ONR7a additionnés respectivement de 0,1% (v/v) de pétrole brut, d’un
mélange de n-alcanes (C 14 + C 16 + C 18 , 1: 1: 1) ou d’un mélange de benzène /toluène/xylène
(pures) (1:1:1) comme uniques sources de carbone et d’énergie. Des témoins contenant les
mêmes quantités de milieu et d’hydrocarbures mais sans échantillons ont été également
préparés. Tous les flacons ont été incubés pendant 10 jours à 30 ° C sous agitation (180
tr/min) (Hassanshahian et al., 2012).
Ensuite, des aliquotes ont été prélevées et placées dans du milieu frais contenant la même
concentration d'hydrocarbures et incubées dans les mêmes conditions et des dilutions ont été
préparées. Un volume (100 µl) de chaque dilution est étalé sur la surface des boites de pétri
contenant du milieu ONR7a solide (ONR7a Agar) avec les mêmes hydrocarbures imbibant un
papier filtre stérile placé sur le couvercle de la boîte. Les boites ont été incubées à 30 ° C.
Des colonies phénotypiquement différentes obtenues à partir des boites ont fait l’objet de
purification par repiquages successives sur milieu ONR7a Agar, jusqu’à l’obtention de
colonies pures.