CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
96
IV.4.5 Dépôt des échantillons et système électrophorétique.
L'électrophorèse a été réalisée avec le système pPhor-U2 (Ingeny, Leiden, Pays-Bas). La
cuve à électrophorèse est semblable à un aquarium rectangulaire. Elle contient 17 litres de
tampon TAE (1×) (TRIS 40 mM, Acétate 20 mM, EDTA 1 mM).
Un thermostat régule la température du tampon brassé en permanence par une turbine.
L'anode est fixée au fond de la cuve. Après une heure de polymérisation de l'acrylamide, le
gel coulé est installé sur un support vertical. Les puits du gel sont rincés abondamment avec
du TAE 1×, et le dépôt des échantillons constitué par 20 µl de produit de PCR et de 5 µl de
solution de dépôt (bleu de DGGE: bleu de bromophénol- xylène- cyanol) est effectué.
L'ensemble plaque et support est immergé dans la cuve préalablement chauffée à 60°C. La
migration est d’abord conduite utilisé à basse tension (20V), puis à 80V. La température de
60°C est maintenue jusqu'à la fin de la migration par l'intermédiaire d'un bain thermostaté.
Elle contribue au maintien de l'effet dénaturant (figure 37).
Figure 37. Cuve d’électrophorèse contenant la plaque en verre avec le gel.
Après 17h de migration, le gel a été coloré pendant 40 minutes dans un bain de SYBR_Gold I
1X (Invitrogen CA, USA), puis l’image est capturée avec un gel Doc 2000 (Bio-Rad
Laboratories, Inc., Hercules, CA). Les profils DGGE ont été analysés visuellement et la
position relative de chaque bande a été enregistrée dans une matrice 0-1 qui a été entrée dans
le progiciel PAST et analysée à l'aide d'une analyse en grappes à plusieurs variables basée sur
la dissimilarité de Jaccard.
Matériel & Méthodes
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IV.4.5 Dépôt des échantillons et système électrophorétique.
L'électrophorèse a été réalisée avec le système pPhor-U2 (Ingeny, Leiden, Pays-Bas). La
cuve à électrophorèse est semblable à un aquarium rectangulaire. Elle contient 17 litres de
tampon TAE (1×) (TRIS 40 mM, Acétate 20 mM, EDTA 1 mM).
Un thermostat régule la température du tampon brassé en permanence par une turbine.
L'anode est fixée au fond de la cuve. Après une heure de polymérisation de l'acrylamide, le
gel coulé est installé sur un support vertical. Les puits du gel sont rincés abondamment avec
du TAE 1×, et le dépôt des échantillons constitué par 20 µl de produit de PCR et de 5 µl de
solution de dépôt (bleu de DGGE: bleu de bromophénol- xylène- cyanol) est effectué.
L'ensemble plaque et support est immergé dans la cuve préalablement chauffée à 60°C. La
migration est d’abord conduite utilisé à basse tension (20V), puis à 80V. La température de
60°C est maintenue jusqu'à la fin de la migration par l'intermédiaire d'un bain thermostaté.
Elle contribue au maintien de l'effet dénaturant (figure 37).
Figure 37. Cuve d’électrophorèse contenant la plaque en verre avec le gel.
Après 17h de migration, le gel a été coloré pendant 40 minutes dans un bain de SYBR_Gold I
1X (Invitrogen CA, USA), puis l’image est capturée avec un gel Doc 2000 (Bio-Rad
Laboratories, Inc., Hercules, CA). Les profils DGGE ont été analysés visuellement et la
position relative de chaque bande a été enregistrée dans une matrice 0-1 qui a été entrée dans
le progiciel PAST et analysée à l'aide d'une analyse en grappes à plusieurs variables basée sur
la dissimilarité de Jaccard.