CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
94
Figure 35. Calcul de la taille de l’amplicon. A. Relation inverse entre le log de la taille et la
distance de migration. B. Aspect du 100 bp ladder après électrophorèse en gel d’agarose (les
nombres indiquent la taille des bandes en bp)
IV.4.4 Préparation du gel polyacrylamide.
Pour la DGGE, les amplicons ont été analysés directement dans un gel de polyacrylamide à
8% préparé à partir d’une solution mère de 30 %. Ce gel résulte de la polymérisation d'une
solution d'acrylamide bisacrylamide (37,5:1) dans un tampon TAE 1× (Tris 40 mM, acide
acétique 20 mM et EDTA 1 M (pH 8,0)) avec un gradient de dénaturation constitué de 35 à
70% d'urée-formamide (100% dénaturant correspondant à 7M d’urée et 40% (v / v) de
formamide désionisé) (tableau 13) (Catania et al., 2016 ; 2018). La solution est coulée entre
deux plaques de verre parfaitement dégraissées par l'éthanol, séparées par deux espaceurs de
1mm d'épaisseur.
Le gradient de dénaturant est réalisé grâce à un préparateur de gradient (formeur de gradient).
Ce dispositif est constitué de deux chambres cylindriques munies chacune à l'intérieur de
barreaux magnétiques, qui assureront l'homogénéité des solutions. Ces réservoirs présentent à
leur base un orifice de communication commandé par une vanne.
Matériel & Méthodes
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Figure 35. Calcul de la taille de l’amplicon. A. Relation inverse entre le log de la taille et la
distance de migration. B. Aspect du 100 bp ladder après électrophorèse en gel d’agarose (les
nombres indiquent la taille des bandes en bp)
IV.4.4 Préparation du gel polyacrylamide.
Pour la DGGE, les amplicons ont été analysés directement dans un gel de polyacrylamide à
8% préparé à partir d’une solution mère de 30 %. Ce gel résulte de la polymérisation d'une
solution d'acrylamide bisacrylamide (37,5:1) dans un tampon TAE 1× (Tris 40 mM, acide
acétique 20 mM et EDTA 1 M (pH 8,0)) avec un gradient de dénaturation constitué de 35 à
70% d'urée-formamide (100% dénaturant correspondant à 7M d’urée et 40% (v / v) de
formamide désionisé) (tableau 13) (Catania et al., 2016 ; 2018). La solution est coulée entre
deux plaques de verre parfaitement dégraissées par l'éthanol, séparées par deux espaceurs de
1mm d'épaisseur.
Le gradient de dénaturant est réalisé grâce à un préparateur de gradient (formeur de gradient).
Ce dispositif est constitué de deux chambres cylindriques munies chacune à l'intérieur de
barreaux magnétiques, qui assureront l'homogénéité des solutions. Ces réservoirs présentent à
leur base un orifice de communication commandé par une vanne.