CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes

 

  92
 
AGTTTGATCA TGGCTCAGAT TGAACGCTGG CGGCAGGCCT AACACATGCA AGTCGAACGG 61
TCAAACTAGT ACCGAGTCTA ACTTGCGACC GCCGTCCGGA TTGTGTACGT TCAGCTTGCC
TAACAGGAAG CAGCTTGCTG CTTTGCTGAC GAGTGGCGGA CGGGTGAGTA ATGTCTGGGA 121
ATTGTCCTTC GTCGAACGAC GAAACGACTG CTCACCGCCT GCCCACTCAT TACAGACCCT
AACTGCCTGA TGGAGGGGGA TAACTACTGG AAACGGTAGC TAATACCGCA TAACGTCGCA 181
TTGACGGACT ACCTCCCCCT ATTGATGACC TTTGCCATCG ATTATGGCGT ATTGCAGCGT
AGCACAAAGA GGGGGACCTT AGGGCCTCTT GCCATCGGAT GTGCCCAGAT GGGATTAGCT 241
TCGTGTTTCT CCCCCTGGAA TCCCGGAGAA CGGTAGCCTA CACGGGTCTA CCCTAATCGA
AGTAGGTGGG GTAACGGCTC ACCTAGGCGA CGATCCCTAG CTGGTCTGAG AGGATGACCA 301
TCATCCACCC CATTGCCGAG TGGATCCGCT GCTAGGGATC GACCAGACTC TCCTACTGGT
GCAACACTGG AACTGAGACA CGGTCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG 361
CGTTGTGACC TTGACTCTGT GCCAGGTCTG AGGATGCCCT CCGTCGTCAC CCCTTATAAC
CACAATGGGC GCAAGCCTGA TGCAGCCATG CNGCGTGTAT GAAGAAGGCC TTCGGGTTGT 421
GTGTTACCCG CGTTCGGACT ACGTCGGTAC GNCGCACATA CTTCTTCCGG AAGCCCAACA
AAAGTACTTT CAGCGGGGAG GAAGGGAGTA AAGTTAATAC CTTTGCTCAT TGACGTTACC 481
TTTCATGAAA GTCGCCCCTC CTTCCCTCAT TTCAATTATG GAAACGAGTA ACTGCAATGG
CGCAGAAGAA GCACCGGCTA ACTCCGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGGA GGGTGCAAGC 541
GCGTCTTCTT CGTGGCCGAT TGAGGCACGG TCGTCGGCGC CATTATGCCT CCCACGTTCG
Figure 33. Positionnement des amorces sur la séquence de l’ADN codant pour l’ARN
ribosomal 16S d’E.coli.
Les ADN sont soumis à 35 cycles d'amplification dans un thermocycleur qui est programmé
au préalable pour la réalisation de cycles comprenant: une dénaturation initiale à 98°C
pendant 30 secondes, suivi de 35 cycles comprenant chacun une dénaturation à 98°C pendant
15 secondes, une hybridation à 66°C pendant 10 secondes et une élongation à 72°C pendant
10 secondes et enfin une élongation finale à 72°C pendant une minute.
Après la PCR, les produits de la réaction sont soumis à la migration électrophorétique en gel
d’agarose 1,5% (figure 34).
• Peser 1,5 gr dans 100 ml de tampon TBE (Tris Borate EDTA) 1X et porter à
ébullition ;
• Laisser refroidir ;
• Ajouter 10 µl de bromure d’éthidium (mettre des gants) ;
• Couler le gel dans le moule contenant un peigne pour former des puits ;
• Laisser solidifier ;
• Retirer délicatement le peigne ;
• Plonger le gel dans la cuve d’électrophorèse contenant du TBE 1X ;
• Charger les puits avec l’ADN à analyser (5µl) additionné de tampon de charge (1 µl)
(Glycerol 30%, Bleu de bromphénol et xylène cyanol). Le tampon de charge permet
de maintenir l’ADN dans le fond du puits et de visualiser le front de migration ;