CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
91
aux quels 978 µl de tampon phosphate de sodium et 122 µl de MT Buffer ont été ajoutés.
Puis les échantillons ont été homogénéisés à l’aide de l’instrument FastPrep pendant 40
secondes à une vitesse 6.0.
L’extraction a été réalisée conformément aux spécifications du fournisseur, sauf dans la
dernière étape, où les acides nucléiques ont été élués avec 50 µl d’eau. (ADN / ARN free
GIBCO). Le protocole détaillé est décrit en Annexe 1.
IV.4.2.3 Contrôle de la qualité et de la taille des ADN.
Après extraction, la qualité et la taille des ADN extraits ont été vérifiées par électrophorèse
sur gel d’agarose (1%). Les gels contenaient 1% (m/v) d’agarose dans un tampon TBE 1X
(Acide borique 90 mM, Tris-base 90 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3). La migration des
différents échantillons a été réalisée sous une tension de 100 volts pendant 30 minutes
environ. Le gel est ensuite coloré au bromure d’éthidium et l’ADN est mis en évidence sous
UV (302 nm). Cette technique permet de vérifier l’intégrité de l’ADN. La présence d’une
trainée (smear) témoigne d’une ADN dégradé.
La concentration et la pureté de l'ADN total extrait des échantillons (eau et sédiment) ont été
déterminées également à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDROP ND-1000 (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA, USA). Les ADN sont conservés à -20 ° C jusqu'à analyse
ultérieure. L’ADN des échantillons d’eau et de sédiment de la station 5 n’ont pas été extrait
par manque d’échantillon.
L’ADN absorbe la lumière à une longueur d’onde optimale de 260 nm alors que les protéines
absorbent l’ADN à 280 nm. 1 DO à 260 nm équivaut à une concentration en ADN double
brin de 50 µg/ml. Le rapport A260 nm/A 280 nm doit être >1.8 pour garantir une pureté
suffisante.
IV.4.3 Amplification par PCR.
La région variable V3 correspondant aux positions 341 à 534 de la séquence d'ARNr 16S
d'Escherichia coli a été amplifiée par PCR à partir d'ADN génomique total en utilisant les
amorces 341f-GC (5’ –CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’) et 534r (5’-ATT ACC GCG GCT
GCT GG-3’) (figure 33) (Muyzer et al., 1993).
L’amplification par PCR a été réalisée dans un volume final de 30 µl contenant 0,48 µl
d’ADN polymérase Phire Hot Start II (Thermo Scientific, Monza, Italie), un tampon PCR 1X,
0,5 µM de chaque amorce, 0,3 mM de dNTP et 1 µl d’ADN (entre 10 et 100 ng).
Matériel & Méthodes
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aux quels 978 µl de tampon phosphate de sodium et 122 µl de MT Buffer ont été ajoutés.
Puis les échantillons ont été homogénéisés à l’aide de l’instrument FastPrep pendant 40
secondes à une vitesse 6.0.
L’extraction a été réalisée conformément aux spécifications du fournisseur, sauf dans la
dernière étape, où les acides nucléiques ont été élués avec 50 µl d’eau. (ADN / ARN free
GIBCO). Le protocole détaillé est décrit en Annexe 1.
IV.4.2.3 Contrôle de la qualité et de la taille des ADN.
Après extraction, la qualité et la taille des ADN extraits ont été vérifiées par électrophorèse
sur gel d’agarose (1%). Les gels contenaient 1% (m/v) d’agarose dans un tampon TBE 1X
(Acide borique 90 mM, Tris-base 90 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3). La migration des
différents échantillons a été réalisée sous une tension de 100 volts pendant 30 minutes
environ. Le gel est ensuite coloré au bromure d’éthidium et l’ADN est mis en évidence sous
UV (302 nm). Cette technique permet de vérifier l’intégrité de l’ADN. La présence d’une
trainée (smear) témoigne d’une ADN dégradé.
La concentration et la pureté de l'ADN total extrait des échantillons (eau et sédiment) ont été
déterminées également à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDROP ND-1000 (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA, USA). Les ADN sont conservés à -20 ° C jusqu'à analyse
ultérieure. L’ADN des échantillons d’eau et de sédiment de la station 5 n’ont pas été extrait
par manque d’échantillon.
L’ADN absorbe la lumière à une longueur d’onde optimale de 260 nm alors que les protéines
absorbent l’ADN à 280 nm. 1 DO à 260 nm équivaut à une concentration en ADN double
brin de 50 µg/ml. Le rapport A260 nm/A 280 nm doit être >1.8 pour garantir une pureté
suffisante.
IV.4.3 Amplification par PCR.
La région variable V3 correspondant aux positions 341 à 534 de la séquence d'ARNr 16S
d'Escherichia coli a été amplifiée par PCR à partir d'ADN génomique total en utilisant les
amorces 341f-GC (5’ –CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’) et 534r (5’-ATT ACC GCG GCT
GCT GG-3’) (figure 33) (Muyzer et al., 1993).
L’amplification par PCR a été réalisée dans un volume final de 30 µl contenant 0,48 µl
d’ADN polymérase Phire Hot Start II (Thermo Scientific, Monza, Italie), un tampon PCR 1X,
0,5 µM de chaque amorce, 0,3 mM de dNTP et 1 µl d’ADN (entre 10 et 100 ng).