CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
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dénaturant (urée) qui va entrainer leur dénaturation progressive au fur et à mesure de la
migration en fonction de leur richesse en GC. Cette dénaturation entraîne un encombrement
stérique qui ne permet plus au fragment de migrer dans le gel d’acrylamide. Le fragment en
question se retrouve ainsi « piégé dans les mailles du filet ».
Pour une même teneur en agent dénaturant, un fragment riche en GC se dénaturera moins vite
qu’un fragment riche en liaisons AT (du fait du nombre de liaisons hydrogène inter brin) et
migrera donc plus loin sur le gel. D’un point de vue théorique, chaque bande visualisée sur le
gel correspond à une espèce bactérienne. La DGGE permet en effet de séparer les fragments
d’ADN ne se différenciant que par une seule paire de bases (Casamayor et al., 2000).
A travers la comparaison des empreintes obtenues pour chaque échantillon, la DGGE permet
donc d’évaluer la diversité et l’abondance relative des bactéries d’un échantillon. L’analyse
du gel se fait en notant le nombre de bandes par piste, leurs positions mais aussi l’intensité de
chaque bande.
IV.4.2 Extraction d'ADN.
IV.4.2.1 Extraction d'ADN des échantillons d’eau de mer.
L’extraction d’ADN des échantillons d’eau a été réalisée en utilisant le kit d’extraction
d'ADN et d'ARN MasterPure ™ (Epicenter, Madison, WI). La précipitation des acides
nucléiques totaux a été réalisée conformément aux instructions du fabricant.
Des filtres 0,2 µm de porosité (Millipore, Milan, Italie) ont été utilisés pour l’extraction de
l’ADN, 100 ml d’échantillons ont été filtrés, puis 300 µl de solution de lyse (Tissue and cell
lysis solution, fournie avec le kit) et 1 µl de Protéinase K (20 µg/ml) ont été ajouté. Les
filtres ont été transférés dans des tubes de 1,5 ml. Les échantillons ont été incubés à 65 ° C
pendant 15 minutes, transférés sur de la glace pendant 5 minutes et le filtre a été retiré. La
précipitation des acides nucléiques totaux a été réalisée conformément aux instructions du
fabricant. Les acides nucléiques totaux ont été mis en suspension dans 50 µl de tampon TE
préchauffé à 45 °C. le protocole détaillé est décrit en Annexe 1
IV.4.2.2 Extraction d'ADN des échantillons de sédiment.
L’ADN total des échantillons de sédiments a été extrait à l’aide du kit pour sol FastDNA ™
SPIN (MP Bio medicals, Santa Ana, Californie).
500 mg d’échantillon de sédiment de chaque station ont été transféré dans une matrice de lyse
Matériel & Méthodes
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dénaturant (urée) qui va entrainer leur dénaturation progressive au fur et à mesure de la
migration en fonction de leur richesse en GC. Cette dénaturation entraîne un encombrement
stérique qui ne permet plus au fragment de migrer dans le gel d’acrylamide. Le fragment en
question se retrouve ainsi « piégé dans les mailles du filet ».
Pour une même teneur en agent dénaturant, un fragment riche en GC se dénaturera moins vite
qu’un fragment riche en liaisons AT (du fait du nombre de liaisons hydrogène inter brin) et
migrera donc plus loin sur le gel. D’un point de vue théorique, chaque bande visualisée sur le
gel correspond à une espèce bactérienne. La DGGE permet en effet de séparer les fragments
d’ADN ne se différenciant que par une seule paire de bases (Casamayor et al., 2000).
A travers la comparaison des empreintes obtenues pour chaque échantillon, la DGGE permet
donc d’évaluer la diversité et l’abondance relative des bactéries d’un échantillon. L’analyse
du gel se fait en notant le nombre de bandes par piste, leurs positions mais aussi l’intensité de
chaque bande.
IV.4.2 Extraction d'ADN.
IV.4.2.1 Extraction d'ADN des échantillons d’eau de mer.
L’extraction d’ADN des échantillons d’eau a été réalisée en utilisant le kit d’extraction
d'ADN et d'ARN MasterPure ™ (Epicenter, Madison, WI). La précipitation des acides
nucléiques totaux a été réalisée conformément aux instructions du fabricant.
Des filtres 0,2 µm de porosité (Millipore, Milan, Italie) ont été utilisés pour l’extraction de
l’ADN, 100 ml d’échantillons ont été filtrés, puis 300 µl de solution de lyse (Tissue and cell
lysis solution, fournie avec le kit) et 1 µl de Protéinase K (20 µg/ml) ont été ajouté. Les
filtres ont été transférés dans des tubes de 1,5 ml. Les échantillons ont été incubés à 65 ° C
pendant 15 minutes, transférés sur de la glace pendant 5 minutes et le filtre a été retiré. La
précipitation des acides nucléiques totaux a été réalisée conformément aux instructions du
fabricant. Les acides nucléiques totaux ont été mis en suspension dans 50 µl de tampon TE
préchauffé à 45 °C. le protocole détaillé est décrit en Annexe 1
IV.4.2.2 Extraction d'ADN des échantillons de sédiment.
L’ADN total des échantillons de sédiments a été extrait à l’aide du kit pour sol FastDNA ™
SPIN (MP Bio medicals, Santa Ana, Californie).
500 mg d’échantillon de sédiment de chaque station ont été transféré dans une matrice de lyse