CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
89
Electrophoresis), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), TRFLP (Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism) qui nécessite l’amplification préalable de gènes
spécifiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qui permet d’amplifier une région
cible du génome. La taxonomie bactérienne moderne étant basée sur la séquence de l’ARN
ribosomal 16S, il suffit d’amplifier les gènes codant pour ces ARN 16S à partir de la
communauté bactérienne et de les séparer par une électrophorèse adaptée et les fragments de
séquences différentes auront une mobilité électrophorétique différente (figure 32).
Figure 32. Principe de la technique DGGE. Les ADN des communautés microbiennes sont
extraits des échantillons environnementaux (1). Les gènes d’intérêt sont ensuite amplifiés par
PCR en utilisant une amorce couplée à un GC-clamp qui est une région riche en GC résistante
à la dénaturation (2). Après purification, les produits PCR sont séparés par électrophorèse, en
fonction de leur composition, selon un gradient de dénaturation chimique (3). Les fragments,
correspondant « théoriquement » à une espèce, peuvent être excisés (4) afin d’être séquencés
(5) (Militon, 2012)
La technique consiste à séparer des fragments d’ADN de taille identique mais de séquences
variables selon leurs propriétés de fusion sur un gel de polyacrylamide contenant un agent
dénaturant. Au cours d’une étape préalable de PCR, les fragments d’ADN sont flanqués d’une
amorce riche en GC qui permettra au fragment de ne pas se dénaturer totalement. Les
fragments ainsi obtenus sont soumis à une électrophorèse contenant un gradient d’agent
Matériel & Méthodes
89
Electrophoresis), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), TRFLP (Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism) qui nécessite l’amplification préalable de gènes
spécifiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qui permet d’amplifier une région
cible du génome. La taxonomie bactérienne moderne étant basée sur la séquence de l’ARN
ribosomal 16S, il suffit d’amplifier les gènes codant pour ces ARN 16S à partir de la
communauté bactérienne et de les séparer par une électrophorèse adaptée et les fragments de
séquences différentes auront une mobilité électrophorétique différente (figure 32).
Figure 32. Principe de la technique DGGE. Les ADN des communautés microbiennes sont
extraits des échantillons environnementaux (1). Les gènes d’intérêt sont ensuite amplifiés par
PCR en utilisant une amorce couplée à un GC-clamp qui est une région riche en GC résistante
à la dénaturation (2). Après purification, les produits PCR sont séparés par électrophorèse, en
fonction de leur composition, selon un gradient de dénaturation chimique (3). Les fragments,
correspondant « théoriquement » à une espèce, peuvent être excisés (4) afin d’être séquencés
(5) (Militon, 2012)
La technique consiste à séparer des fragments d’ADN de taille identique mais de séquences
variables selon leurs propriétés de fusion sur un gel de polyacrylamide contenant un agent
dénaturant. Au cours d’une étape préalable de PCR, les fragments d’ADN sont flanqués d’une
amorce riche en GC qui permettra au fragment de ne pas se dénaturer totalement. Les
fragments ainsi obtenus sont soumis à une électrophorèse contenant un gradient d’agent