CHAPITRE IV
Matériel & Méthodes
88
d’énumérer les bactéries par microscopie optique. Le marqueur utilisé pour cette étude est le
DAPI (4’6- diamidino-2-phenylindole), il se fixe sur l’ADN. Quand le complexe ADN-DAPI
est excité avec une lumière d’une longueur d’onde comprise entre 330 et 380 nm il fluoresce
dans le bleu. Le DAPI fixé sur du matériel non ADN peut fluorescer en jaune pâle. Cette
méthode améliore la visualisation des bactéries et leur distinction des cyanobactéries de taille
inférieure à 1 µm (Porter et Feig, 1980).
Procédure :
• Fixer les échantillons d’eau avec du formaldéhyde (2% v/v) (54 µl pour chaque
millilitre d’échantillon) et conserver à 4°C ;
• Ajouter 100 µl de DAPI pour chaque millilitre d’échantillon fixé ;
• Dans l’appareil à filtration, filtrer d’abord 10 ml d’eau distillée stérilisée pour
équilibrer le filtre (filtre noir, 25 mm de diamètre et 0,22 µm de porosité) ;
• Bien mélanger l’échantillon fixé avec du formaldéhyde, puis le filtrer (en gardant le
même filtre) ;
• Le filtre est ensuite monté entre lame et lamelle avec de l'huile à immersion non
fluorescente (Olympus). Il est préférable d’observer les lames de suite, sinon les
conserver à 4°C mais pas plus de 72h ;
• Les lames ont été examinées au microscope à épifluorescence Zeiss Axioplan 2
Imaging (Zeiss; Carl Zeiss Inc., Thornwood, N.Y.). Les résultats ont été exprimés en
nombre de cellules par millilitre d'eau de mer (Cappello et al., 2007).
IV.4 Détermination de la diversité bactérienne dans les échantillons de sédiment et
d’eau de mer par DGGE.
Afin d’estimer la diversité bactérienne dans l'eau de mer et des échantillons de sédiments
prélevés dans le port de Sidi Fredj, Une technique de culture indépendante DGGE
« Électrophorèse sur gel en gradient dénaturant » a été réalisée.
IV.4.1 Principe de la DGGE.
La DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) est une technique d’électrophorèse
d’ADN permettant de discriminer des fragments d’ADN sur base de leurs séquences et qui
donne une image de la diversité des communautés microbiennes. Elle permet d’évaluer et de
comparer la diversité microbienne sur la base du génotype. Elle appartient à une famille de
techniques d’analyse moléculaire comme la TGGE (Temperature Gradient Gel
Matériel & Méthodes
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d’énumérer les bactéries par microscopie optique. Le marqueur utilisé pour cette étude est le
DAPI (4’6- diamidino-2-phenylindole), il se fixe sur l’ADN. Quand le complexe ADN-DAPI
est excité avec une lumière d’une longueur d’onde comprise entre 330 et 380 nm il fluoresce
dans le bleu. Le DAPI fixé sur du matériel non ADN peut fluorescer en jaune pâle. Cette
méthode améliore la visualisation des bactéries et leur distinction des cyanobactéries de taille
inférieure à 1 µm (Porter et Feig, 1980).
Procédure :
• Fixer les échantillons d’eau avec du formaldéhyde (2% v/v) (54 µl pour chaque
millilitre d’échantillon) et conserver à 4°C ;
• Ajouter 100 µl de DAPI pour chaque millilitre d’échantillon fixé ;
• Dans l’appareil à filtration, filtrer d’abord 10 ml d’eau distillée stérilisée pour
équilibrer le filtre (filtre noir, 25 mm de diamètre et 0,22 µm de porosité) ;
• Bien mélanger l’échantillon fixé avec du formaldéhyde, puis le filtrer (en gardant le
même filtre) ;
• Le filtre est ensuite monté entre lame et lamelle avec de l'huile à immersion non
fluorescente (Olympus). Il est préférable d’observer les lames de suite, sinon les
conserver à 4°C mais pas plus de 72h ;
• Les lames ont été examinées au microscope à épifluorescence Zeiss Axioplan 2
Imaging (Zeiss; Carl Zeiss Inc., Thornwood, N.Y.). Les résultats ont été exprimés en
nombre de cellules par millilitre d'eau de mer (Cappello et al., 2007).
IV.4 Détermination de la diversité bactérienne dans les échantillons de sédiment et
d’eau de mer par DGGE.
Afin d’estimer la diversité bactérienne dans l'eau de mer et des échantillons de sédiments
prélevés dans le port de Sidi Fredj, Une technique de culture indépendante DGGE
« Électrophorèse sur gel en gradient dénaturant » a été réalisée.
IV.4.1 Principe de la DGGE.
La DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) est une technique d’électrophorèse
d’ADN permettant de discriminer des fragments d’ADN sur base de leurs séquences et qui
donne une image de la diversité des communautés microbiennes. Elle permet d’évaluer et de
comparer la diversité microbienne sur la base du génotype. Elle appartient à une famille de
techniques d’analyse moléculaire comme la TGGE (Temperature Gradient Gel