Chapitre II : La caractérisation de la phylogénie et de la résistance aux antibiotiques des
souches d’Escherichia coli isolées à partir de la moule « mytilus galloprovincialis ».
Matériels et méthodes
 La phase d'élongation
Lors de cette étape, la synthèse de la séquence d'ADN cible a lieu grâce à une enzyme, la Taqpolymérase. A la fin de ce premier cycle de l'ADN double brin est obtenu et un nouveau cycle peut
alors recommencer.
II.5.2 Conditions de PCR
Les réactions de PCR de chaque gène se sont déroulées selon le programme suivant :
Une étape de dénaturation de 94°C pendant 5min puis 30 cycles de PCR constitué chacun d'une étape de
dénaturation à 94°C/ 30sec, d'hybridation à 55°C / 30 sec et d'élongation à 72°C / 30sec. Enfin, une étape
d'élongation finale à 72°C / 7min.
II.5.3 Recherche des groupes phylogénétiques
Les groupes phylogénétique d' E. coli ont été déterminés sur la base de l'amplification de trois marqueurs
génétiques selon Clermont et al, (2000): chuA : gène nécessaire pour le transport de l'hème chez E.coli
entérohémorragique O157:H7, yjaA : gène de fonction inconnue identifié chez E.coli K12 et TspE4.C2
: fragment d'ADN anonyme (Tableau 2) Les groupes phylogénétiques sont comme suit: B2 (chua+,
yjaA+), D (chua+, yjaA-), B1 (chua-, TspE4.C2+) ou A (chua-, TspE4.C2-) (Clermont et al., 2000).
II.5.4 Mélange réactionnel
Les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume final de 12.5 µl contenant les concentrations
finales suivantes :
PCR Master mix 1X (Proméga) …………………………
6.25 µ1
Amorces sens……………………………………………...
0.25 µM
Amorces antisens ……………………………………….
0.25 µM
ADN……………………………………………………….
2.5 µl
Eau ………………………………………………………..
3.25 µl
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