Chapitre II : La caractérisation de la phylogénie et de la résistance aux antibiotiques des
souches d’Escherichia coli isolées à partir de la moule « mytilus galloprovincialis ».
Matériels et méthodes
sont mises en évidence par l'apparition d'une image d'antagonisme entre un antibiotique inducteur
(céfoxitine ou imipenème) et un antibiotique actif (une céphalosporine de 3
ème ou 4
ème génération).
Cet antagonisme se traduit par la diminution de l'activité de la béta-lactamine initialement active,
grâce à la production d'une céphalosporinase inductible (Vedel, 2005).
II.4 Extraction de l'ADN
Principes
C'est une technique de séparation biochimique par solubilisation préférentielle des molécules dans
deux phases liquides non miscibles.
Technique
 Préparer l'inoculum bactérien : 3 à 4 colonies dans 50µl d’eau distillée stérile
 Mettre l'inoculum à 100°C pendant 10min pour la lyse
 Centrifuger à 12000trs/min pendant 3min
 Récupérer le surnageant
II.5 Détermination des groupes phylogénétique par PCR
II.5.1 Principe de la PCR
La « Polymerase Chain Reaction » est une réaction enzymatique qui permet de sélectionner puis
d'amplifier en une très grande quantité, un fragment d'ADN particulier présent en très faible quantité au départ
(Hoorfart et al., 2004).
La PCR est une suite de cycles (20 à 40 cycles), qui se répètent en boucle, comportant chacun trois paliers
de température (Hoorfar et al., 2004).
Chaque cycle comporte les étapes suivantes :
 La phase de dénaturation
Lors de cette étape très courte (environ une minute), une dénaturation d'une séquence cible d'ADN
double brin est réalisée entrainant la formation de deux ADN simple brin.
 La phase d'hybridation des amorces
Cette étape permet aux amorces de se fixer des deux côtés du fragment d'ADN simple brin spécifique à
amplifier. La température de cette étape est fixée en fonction de la température de fusion (Tm) des
amorces.
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