Chapitre 02
méthodologie
44
L’échantillon est laissé dans une solution EDTA (0,2M, 1:10(w/v), au réfrigérateur
pendant 48h a température de 4°C .La solution est filtrée sur une passoire, et lavée à l’eau
distillée jusqu’à neutralisation.
La pré-extraction du collagène s’effectue dans une solution d’Acide Acétique (0,5 M)
pendant 4 jours au réfrigérateur à 4°C. La solution visqueuse est centrifugée à 14000g
pendant 30 min à 4°C. Les surnageant du mélange est récupéré. Une solution NaCl (2.4M) et
une autre de l’acide acétique (0.5M) sont ajoutées successivement pour le but de précipiter le
collagène.
La solution est dialysée contre de l’eau distillée pendant 48heures à 4°C. Le produit de
dialyse est lyophilisé puis broyé pour obtenir une poudre de collagène.
IV.2. 3. Control de qualité des extraits
IV.2.3.1. Test de mise en évidence des protéines
Test de biuret:
a. Principe
La réaction du biuret est une réaction mettant en évidence les liaisons peptidiques.
La méthode consiste à mettre en milieu basique des ions cuivre en présence de protéines.
Un complexe coloré mauve ou violet se forme en effet lorsque les ions Cu sont complexés par
deux groupes carbonyles présents de part et d'autre d'une des liaisons peptidiques de la
protéine. Plus le nombre des liaisons est grand, plus la densité de couleur est importante
(Gornall et al. 1949).
b. Méthode :
3 tubes à essais ont été préparés:
1
er tube: test positif (albumin bovine +NaOH +CuSO 4 )
2
ème tube: test négatif (eau distillée + NaOH + CuSO 4 )
3
ème tube: l’échantillon à tester (gélatine/collagène + NaOH + CuSO 4 )
Le test est positif lorsqu'une couleur violette (ou rose) apparait.
IV.2.3.2. Dosage des protéines
Le dosage des protéines dans la gélatine et le collagène se fait par la méthode Kjeldahl
(voir section III.2.3.2).Le contrôle a été réalisé pour 1g d’échantillon.
méthodologie
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L’échantillon est laissé dans une solution EDTA (0,2M, 1:10(w/v), au réfrigérateur
pendant 48h a température de 4°C .La solution est filtrée sur une passoire, et lavée à l’eau
distillée jusqu’à neutralisation.
La pré-extraction du collagène s’effectue dans une solution d’Acide Acétique (0,5 M)
pendant 4 jours au réfrigérateur à 4°C. La solution visqueuse est centrifugée à 14000g
pendant 30 min à 4°C. Les surnageant du mélange est récupéré. Une solution NaCl (2.4M) et
une autre de l’acide acétique (0.5M) sont ajoutées successivement pour le but de précipiter le
collagène.
La solution est dialysée contre de l’eau distillée pendant 48heures à 4°C. Le produit de
dialyse est lyophilisé puis broyé pour obtenir une poudre de collagène.
IV.2. 3. Control de qualité des extraits
IV.2.3.1. Test de mise en évidence des protéines
Test de biuret:
a. Principe
La réaction du biuret est une réaction mettant en évidence les liaisons peptidiques.
La méthode consiste à mettre en milieu basique des ions cuivre en présence de protéines.
Un complexe coloré mauve ou violet se forme en effet lorsque les ions Cu sont complexés par
deux groupes carbonyles présents de part et d'autre d'une des liaisons peptidiques de la
protéine. Plus le nombre des liaisons est grand, plus la densité de couleur est importante
(Gornall et al. 1949).
b. Méthode :
3 tubes à essais ont été préparés:
1
er tube: test positif (albumin bovine +NaOH +CuSO 4 )
2
ème tube: test négatif (eau distillée + NaOH + CuSO 4 )
3
ème tube: l’échantillon à tester (gélatine/collagène + NaOH + CuSO 4 )
Le test est positif lorsqu'une couleur violette (ou rose) apparait.
IV.2.3.2. Dosage des protéines
Le dosage des protéines dans la gélatine et le collagène se fait par la méthode Kjeldahl
(voir section III.2.3.2).Le contrôle a été réalisé pour 1g d’échantillon.