Annexe I
-65F1 ou F2 avec R1 ou R2 : 95°C 2’ puis 35 fois 94°C pendant 0.5’, 54° pendant 0.5’, 72°C pendant
1’
Mode opératoire de l’électrophorèse :
 Préparation du gel d’agarose à 1% :
Peser 1.2g d’agarose
Ajouter 2.4g de tris EDTA 50 x
Ajouter 120g d’eau distillée
Laisser bouillir pendant 3 minutes au micro-onde.
Repeser et compléter avec de l’eau distillée jusqu'à 120 g.
Refroidir jusqu'à ce que la température soit au environ de 50°C
Ajouter 2 gouttes de bromure d’éthidium
 Préparation de l’appareil
Placer les 2 bords de la cuve et les peignes pour former les puits
Couler le gel d’agarose à 1 %
Attendre 30 minutes pour que le gel se solidifie
Enlever les bords et les peignes
Verser le tampon jusqu'à ce que les électrodes soient immergées
Déposer 20 µl du marqueur de taille dans l’avant dernier puits de chaque coté
Centrifuger les échantillons sortis du thermocycleur
Déposé 24.5 µl de chaque échantillon dans un puits (le mélange a une densité suffisante pour couler
directement dans le puits une fois il est déposé)
Soumettre l’ADN à un champ électrique de 100 V pendant 50 minutes
Une fois l’électrophorèse terminée, observer le gel dans une chambre noire sous lampe UV
Découpé les morceaux de gel qui présente une grande quantité de fragments dans des tubes
Mode opératoire de l’extraction du gel
 Ajouter 500 µl de MBS (Membrane Buiding solution)
 Dissoudre à 55°C pendant 30 minutes
 Transférer l’échantillon sur la membrane et attendre pendant 5 minutes
 Centrifuger 10 000 rpm pendant 1 minute
 Jeter le culot
 Ajouter 550 µl de MWS (Membrane Wash Soluttion)
 Centrifuger 10 000 rmp pendant 1 minute
 Jeter le culot
 Ajouter 550 µl de MWS (Membrane Wash Soluttion)