Annexe I
-64 Ajouter 200 µl d’Ethanol à 96-100%
 Transférer le tout sur la membrane en silice et centrifuger 8 000 rpm (6 000rcf) pendant 1
minute
 Jeter le tube et replacer la membrane dans un nouveau tube
 Ajouter 500 µl de buffer AW 1 et centrifuger 8 000 rpm pendant1 minute
 Jeter le tube et replacer la membrane dans un nouveau tube
 Ajouter 500 µl de buffer AW 2 et centrifuger 20 000 rpm pendant 3 minutes
 Transférer les membranes dans des eppendorf
 Eluer l’ADN en ajoutant 200 µl de buffer AE
 Incuber 1 minute à température ambiante
 Centrifuger 8 000 rpm pendant 1 minute
Mode opératoire de la PCR:
La PCR s’effectue dans de petits tubes, dans chaque tube, ajouter :
1.5 µl d’ADN
1 µl d’amorce sens
1 µl d’amorce reverse
9 µl d’eau distillée
12.5 µl du mix goTaq
V f =25 µl
Une fois le mélange réalisé, centrifuger pendant 10 secondes pour que le mélange se trouve bien
dans le fond
Introduire les tubes dans le thermocycleur et lancer le programme d’amplification
La PCR est réalisée avec la combinaison des amorces suivantes :
S83 (5’ –TCTACYAACCACAAAGAYATCGGGA-3)
S156 (5’-CTCAGCCATCCTACCTGTGGCAA-3’) (Iglesias et al., 2016)
R249 (5’-ACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’) (Iglesias et al., 2016)
FishF1 (5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′) (Ward et al.,2005)
FishF2 (5′-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3') (Ward et al.,2005)
FishR1-(5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′) (Ward et al.,2005)
FishR2-(5′-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′) (Ward et al.,2005)
Le Y veux dire la présence de deux type d’amorce, une contenant le C et une autre contenant le T,
le R : A et G.
Les températures et les durées appliquées pour chaque couple d’amorces sont comme suit
S83 ou S156 avec R249 : 94°C 2’ puis 39 fois 94°C pendant 1’, 56°C pendant 1’, 72°C pendant 3’.