Annexe I
-63Mode opératoire de la méthode CTAB :
Solubilisation du tissu
 Numéroter les tubes
 Prendre un petit morceau de chair et le mettre dans l’eppendorf
 Ajouter 400 µl de CTAB
 Ajouter 20 µl de protéinase K
 Vortexer et incuber à 56°C pendant 1-2h
Précipitation de protéine
 Ajouter 400µl de chloroforme/isoamylol (24/1)
 Vortexer
 Centrifuger 14 000 rpm (18 000 rcf) pendant 30 minutes
 A l’aide d’une pipette prélever la phase aqueuse et la transférer dans un autre tube
(V=400µl)
Précipitation de l’ADN
 Ajouter 1/10 volume de Na OAC à 3M, pH=5.2 (V=400µl, 1/10v=40µl donc V f =440µl)
 Ajouter 2 volumes d’Ethanol à 100% (Vf=440, 2V f =880µl)
 Centrifuger 14 000 rpm (18 000 rcf) pendant 20 minutes
 Vider les tubes et ne garder que le précipité qui apparait en blanc (pelote d’ADN)
Lavage à l’Ethanol 70%
 Ajouter 1 ml d’Ethanol
 Centrifuger 14 000 rpm (18 000 rcf) pendant 15 minutes
 Vider les tubes de l’Ethanol
 Sécher au speed vac pendant 15 minutes
Redissolution de l’ADN
 Ajouter 200µl de tris EDTA à pH=8 et attendre quelque instant
 Vortexer
 Incuber à 55°C pendant quelques minutes
Mode opératoire de la méthode du kit Qiagen
 Prélever un morceau de tissu et le mettre dans un tube
 Ajouter 180 µl de buffer ATL
 Ajouter 20 µl de protéinase K
 Vortexer puis incuber à 56°C pendant 1-2h
 Ajouter 200 µl de buffer AL et incuber à 56°C pendant 30 minutes