Chapitre II : Matériel et méthodes
-33Figure 2.7: les étapes de l'extraction du Gel d’agarose avec le kit
4.3.5.5. Réaction de séquençage
La méthode utilisée actuellement pour la réaction de séquençage a était proposée par Frederick
Sanger en 1977, elle repose sur le même principe que celui de la PCR, la différence réside dans
l’utilisation d’une seule amorce (sens ou revers) et l’addition des ddNTP.
Les ddNTP diffèrent dans dNTP par leurs extrémité 3’, l’extrémité 3’ OH des dNTP est remplacée
par une extrémité 3’H, cette modification empêche la formation de la liaison phosphodiester entre
les ddNTP incorporées et le nucléotide suivant ce qui arrête la synthèse du brin complémentaire.
Dans le milieu réactionnel, il y a une compétition entre les dNTP et les ddNTP, le rapport
spécifique ddNTP/dNTP est optimisé de telle façon qu’un ddNTP soit statistiquement incorporé à
toutes les positions (Gibson et Muse, 2004).
4.3.5.6. Purification des produits de la réaction de séquençage
Les produits de la réaction de séquençage sont purifiés pour éliminer les ddNTP non incorporées et
qui peuvent paralyser les signaux de fluorescence.
Pour cela, le kit de purification Millipore est utilisé, les produits sont mélangés à une solution et
déposé sur une plaque qui contient des mini pores, sous l’effet de la pression, les éléments libres
vont passer à travers les pores et il ne reste que les fragments de grandes tailles.
Après deux lavages pour bien éliminer les résidus, les fragments d’ADN sont récupérés dans la
même solution et transféré vers une autre plaque pour être introduits dans le séquenceur.
Le mode opératoire de chaque étape est en annexe I.
4.3.5.7. Séquençage
Le séquençage est effectué avec le séquenceur automatique ABIPrism 310 Genetic Analyser
(Applied Biosystems), il utilise un système d’électrophorèse sur capillaire, cela permet d’appliquer
Solubiliser
Fixation
Lavage
Eluer
ADN pure
-33Figure 2.7: les étapes de l'extraction du Gel d’agarose avec le kit
4.3.5.5. Réaction de séquençage
La méthode utilisée actuellement pour la réaction de séquençage a était proposée par Frederick
Sanger en 1977, elle repose sur le même principe que celui de la PCR, la différence réside dans
l’utilisation d’une seule amorce (sens ou revers) et l’addition des ddNTP.
Les ddNTP diffèrent dans dNTP par leurs extrémité 3’, l’extrémité 3’ OH des dNTP est remplacée
par une extrémité 3’H, cette modification empêche la formation de la liaison phosphodiester entre
les ddNTP incorporées et le nucléotide suivant ce qui arrête la synthèse du brin complémentaire.
Dans le milieu réactionnel, il y a une compétition entre les dNTP et les ddNTP, le rapport
spécifique ddNTP/dNTP est optimisé de telle façon qu’un ddNTP soit statistiquement incorporé à
toutes les positions (Gibson et Muse, 2004).
4.3.5.6. Purification des produits de la réaction de séquençage
Les produits de la réaction de séquençage sont purifiés pour éliminer les ddNTP non incorporées et
qui peuvent paralyser les signaux de fluorescence.
Pour cela, le kit de purification Millipore est utilisé, les produits sont mélangés à une solution et
déposé sur une plaque qui contient des mini pores, sous l’effet de la pression, les éléments libres
vont passer à travers les pores et il ne reste que les fragments de grandes tailles.
Après deux lavages pour bien éliminer les résidus, les fragments d’ADN sont récupérés dans la
même solution et transféré vers une autre plaque pour être introduits dans le séquenceur.
Le mode opératoire de chaque étape est en annexe I.
4.3.5.7. Séquençage
Le séquençage est effectué avec le séquenceur automatique ABIPrism 310 Genetic Analyser
(Applied Biosystems), il utilise un système d’électrophorèse sur capillaire, cela permet d’appliquer
Solubiliser
Fixation
Lavage
Eluer
ADN pure