Chapitre II : Matériel et méthodes
-34une différence de potentiel qui fera migrer l’ADN qui est chargé négativement du pole négatif vers
le pole positif dans un support de migration.
Pour adapter cette méthode à la fluorescence, sur chaque ddNTP ont été fixés deux fluorochromes,
le premier fluorochrome donneur commun aux quatre ddNTP et le second est la dichlorochrom
(fluorochrome accepteur) spécifique à chaque ddNTP.
Pendant le passage de l’ADN dans le capillaire, le séquenceur émet un laser qui excite le
fluorochrome donneur, ce dernier excite à son tour le fluorochrome accepteur qui réémettra une
fluorescence à une longueur d’onde qui diffère selon le ddNTP.
La fluorescence passe à travers un filtre qui sélectionne uniquement celle provenant des capillaires
et élimine la lumière directe provenant du laser.
La caméra collecte les fluorescences, les corriges et les identifie, les chromatogrammes sont ensuite
accessibles a traves le logiciel « foundation data collection version 3.0 ».
4.3.5.8. Analyse des séquences
a- Nettoyage des séquences : cette opération est réalisée manuellement, elle se fait avec le logiciel
BioEdit et consiste à
Repérer le début du gène et enlever les nucléotides des amorces.
Relire la séquence donnée par l’ordinateur et la comparer avec le chromatogramme car elle est
souvent erronée au départ et à la fin lorsque le signal affiche des perturbations.
Il faut aussi vérifier si la séquence ne présente pas plusieurs pics dans un même endroit qui sont
due à une contamination au moment de la manipulation.
Si le gène a été séquencé avec 2 amorces différentes ; sens et reverse on obtient deux séquence
courte et pour avoir une seule séquence complète on procède de la manière suivante
Aligner les deux séquences sens et revers.
Inverser la séquence revers en utilisant l’option Sequence > manipulations > Reverse.
Rechercher la région ou les deux séquences se superposent.
Combiner les deux séquences en prenant le début de la première (sens) et la fin de la
deuxième ou la séquence reverse (amplicon).
Une fois toutes les séquences nettoyées, elles sont alignées, coupées toutes au même endroit pour
avoir le même nombre de paires de bases et traité avec le logiciel MEGA
b- Construction des phylogrammes
Afin de déterminer la limite des espèces, des arbres phylogénétiques de type Neighboor joining ont
était conçue avec le logiciel MEGA 6 en utilisant le modèle Kimura 2- parameter, la robustesse des
-34une différence de potentiel qui fera migrer l’ADN qui est chargé négativement du pole négatif vers
le pole positif dans un support de migration.
Pour adapter cette méthode à la fluorescence, sur chaque ddNTP ont été fixés deux fluorochromes,
le premier fluorochrome donneur commun aux quatre ddNTP et le second est la dichlorochrom
(fluorochrome accepteur) spécifique à chaque ddNTP.
Pendant le passage de l’ADN dans le capillaire, le séquenceur émet un laser qui excite le
fluorochrome donneur, ce dernier excite à son tour le fluorochrome accepteur qui réémettra une
fluorescence à une longueur d’onde qui diffère selon le ddNTP.
La fluorescence passe à travers un filtre qui sélectionne uniquement celle provenant des capillaires
et élimine la lumière directe provenant du laser.
La caméra collecte les fluorescences, les corriges et les identifie, les chromatogrammes sont ensuite
accessibles a traves le logiciel « foundation data collection version 3.0 ».
4.3.5.8. Analyse des séquences
a- Nettoyage des séquences : cette opération est réalisée manuellement, elle se fait avec le logiciel
BioEdit et consiste à
Repérer le début du gène et enlever les nucléotides des amorces.
Relire la séquence donnée par l’ordinateur et la comparer avec le chromatogramme car elle est
souvent erronée au départ et à la fin lorsque le signal affiche des perturbations.
Il faut aussi vérifier si la séquence ne présente pas plusieurs pics dans un même endroit qui sont
due à une contamination au moment de la manipulation.
Si le gène a été séquencé avec 2 amorces différentes ; sens et reverse on obtient deux séquence
courte et pour avoir une seule séquence complète on procède de la manière suivante
Aligner les deux séquences sens et revers.
Inverser la séquence revers en utilisant l’option Sequence > manipulations > Reverse.
Rechercher la région ou les deux séquences se superposent.
Combiner les deux séquences en prenant le début de la première (sens) et la fin de la
deuxième ou la séquence reverse (amplicon).
Une fois toutes les séquences nettoyées, elles sont alignées, coupées toutes au même endroit pour
avoir le même nombre de paires de bases et traité avec le logiciel MEGA
b- Construction des phylogrammes
Afin de déterminer la limite des espèces, des arbres phylogénétiques de type Neighboor joining ont
était conçue avec le logiciel MEGA 6 en utilisant le modèle Kimura 2- parameter, la robustesse des