Chapitre II : Matériel et méthodes
-32Afin de déterminer la longueur des fragments, un marqueur
de taille qui est l’ADN du phage Lambda digéré par une
enzyme de restriction Pst I est déposé dans un puits témoin.
Le phage lambda est un bactériophage qui peut infecter
Escherichia coli, son ADN est bicaténaire et constitué de
48502 paires de bases, il a été entièrement séquencé.
L’enzyme de restriction le découpe a des endroits connus
pour donner 29 fragments de différentes tailles qui vont
migrer sur le gel d’agarose en même temps que l’ADN et
vont donner le schéma représenté dans la figure 2.6.
Les 2 colorants que contient le mix permettent de suivre le
déroulement de l’électrophorèse, ils sont chargés
négativement et donc migrent dans le même sens que
l’ADN ;
Le bleu de bromophénol migre à la même distance qu’un
fragment d’environ 500 paires de bases et le jaune de cyanol
à la même distance qu’un fragment d’environ 40 paires de
bases.
Le gel et le tampon contiennent le Bromure d’éthidium qui a
la propriété de s’intercaler entre les bases
azotées de l’ADN et émettre une fluorescence
dans l’ultra-violet ce qui permet de visualiser les fragments d’ADN et récupérer le gel dans des
eppendorfs pour l’extraire par la suite.
4.3.5.4. Extraction du gel d’agarose
L’extraction du gel se fait avec le kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Le
morceau de gel est dissous à 55°C dans une solution MBS, la solution est ensuite placée dans la
Quick Gel Extraction Column contenant une membrane de silice.
L'ADN est fixé sur la membrane par centrifugation. La membrane est ensuite lavée 2 fois avec le
tampon de lavage MWS contenant de l'éthanol pour éliminer les impuretés et l'ADN purifié est
ensuite élué dans un tube de récupération à l'aide du tampon d'élution TEDS, la figure 2.7
schématise les différentes étapes. L'ADN purifié est approprié pour une utilisation dans une large
gamme d'applications (Pelt-Verkuil et Van, 2008)
.
Figure 2.6: Tailles des fragments témoins de l'ADN
phage lambda digéré par l'enzyme de restriction Pst I
-32Afin de déterminer la longueur des fragments, un marqueur
de taille qui est l’ADN du phage Lambda digéré par une
enzyme de restriction Pst I est déposé dans un puits témoin.
Le phage lambda est un bactériophage qui peut infecter
Escherichia coli, son ADN est bicaténaire et constitué de
48502 paires de bases, il a été entièrement séquencé.
L’enzyme de restriction le découpe a des endroits connus
pour donner 29 fragments de différentes tailles qui vont
migrer sur le gel d’agarose en même temps que l’ADN et
vont donner le schéma représenté dans la figure 2.6.
Les 2 colorants que contient le mix permettent de suivre le
déroulement de l’électrophorèse, ils sont chargés
négativement et donc migrent dans le même sens que
l’ADN ;
Le bleu de bromophénol migre à la même distance qu’un
fragment d’environ 500 paires de bases et le jaune de cyanol
à la même distance qu’un fragment d’environ 40 paires de
bases.
Le gel et le tampon contiennent le Bromure d’éthidium qui a
la propriété de s’intercaler entre les bases
azotées de l’ADN et émettre une fluorescence
dans l’ultra-violet ce qui permet de visualiser les fragments d’ADN et récupérer le gel dans des
eppendorfs pour l’extraire par la suite.
4.3.5.4. Extraction du gel d’agarose
L’extraction du gel se fait avec le kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Le
morceau de gel est dissous à 55°C dans une solution MBS, la solution est ensuite placée dans la
Quick Gel Extraction Column contenant une membrane de silice.
L'ADN est fixé sur la membrane par centrifugation. La membrane est ensuite lavée 2 fois avec le
tampon de lavage MWS contenant de l'éthanol pour éliminer les impuretés et l'ADN purifié est
ensuite élué dans un tube de récupération à l'aide du tampon d'élution TEDS, la figure 2.7
schématise les différentes étapes. L'ADN purifié est approprié pour une utilisation dans une large
gamme d'applications (Pelt-Verkuil et Van, 2008)
.
Figure 2.6: Tailles des fragments témoins de l'ADN
phage lambda digéré par l'enzyme de restriction Pst I