Chapitre II : Matériel et méthodes
-30L’ADN est suspendu et récupéré dans le tris EDTA à pH=8.
Méthode du kit DNeasy Blood and Tissue Qiagen
Cette méthode utilise la propriété de l’ADN de se coller sur la silice. Il est absorbé spécifiquement
sur la membrane de silice en présence de certains sels et à un pH particulier. Les contaminants
cellulaires sont éliminés par les différentes étapes de lavage. L’ADN est finalement élué dans un
tampon faible en sel ou tampon d’élution. Des sels sont inclus pour aider la dénaturation de
protéines et l’extraction d’ADN. L’avantage de cette technologie est qu’elle peut être incorporée
dans des colonnes de centrifugation ou des micro-puces, elle est rentable, présente une procédure
plus simple et plus rapide que l’extraction organique et est adaptée pour l’automatisation.
4.3.5.2. Amplification de l’ADN par PCR (Polymerase chain reaction) :
Cette méthode a été inventée par Kary Bank Mullis en 1993, c’est une technique qui permet
d’obtenir par réplication in vitro de multiples copies d’une séquence d’ADN comprise entre 2 zones
connues s’hybridant chacune avec une des amorces choisies.
Elle exploite le processus de la réplication en faisant appel à la capacité de l’ADN polymérase à
synthétiser le brin complémentaire de l’ADN matrice. Pour initier le processus, des amorces
s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN
polymérase de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de
nouveaux ADN doubles brins.
Elle est réalisée dans un mélange réactionnel comprenant :
L’ADN déjà extrait
L’eau distillée
Les amorces sens et revers
Le Mix Green GoTaq : c’est une solution qui contient les dNTP, MgCl 2 , le tampon qui
donne au milieu un pH stable et optimal, deux colorants (bleu de bromophénol et le jaune de
cyanol) et l’ADN polymérase.
Les ADN polymérase utilisées proviennent d’une bactérie extrêmophile (ses conditions de vie sont
mortelle pour la plupart des autres organismes) Thermus aquaticus qui vit dans les sources chaudes
et résiste à des températures de l’ordre de 100°C qui sont généralement suffisantes pour dénaturer la
plupart des protéines. La température optimale pour l’activité de la Taq polymérase est de 72°C.
La PCR est assuré par la répétition d’un cycle comprenant 3 étapes qui sont effectuées à des durées
et températures différentes:
Etape 1 : Dénaturation de l’ADN
Elle s’effectue à 94°C, à cette température, les liaisons hydrogènes entre les bases azotées sont
rompues et l’ADN qui été double brin se dénature en un ADN simple brin (ADN monocaténaire).
-30L’ADN est suspendu et récupéré dans le tris EDTA à pH=8.
Méthode du kit DNeasy Blood and Tissue Qiagen
Cette méthode utilise la propriété de l’ADN de se coller sur la silice. Il est absorbé spécifiquement
sur la membrane de silice en présence de certains sels et à un pH particulier. Les contaminants
cellulaires sont éliminés par les différentes étapes de lavage. L’ADN est finalement élué dans un
tampon faible en sel ou tampon d’élution. Des sels sont inclus pour aider la dénaturation de
protéines et l’extraction d’ADN. L’avantage de cette technologie est qu’elle peut être incorporée
dans des colonnes de centrifugation ou des micro-puces, elle est rentable, présente une procédure
plus simple et plus rapide que l’extraction organique et est adaptée pour l’automatisation.
4.3.5.2. Amplification de l’ADN par PCR (Polymerase chain reaction) :
Cette méthode a été inventée par Kary Bank Mullis en 1993, c’est une technique qui permet
d’obtenir par réplication in vitro de multiples copies d’une séquence d’ADN comprise entre 2 zones
connues s’hybridant chacune avec une des amorces choisies.
Elle exploite le processus de la réplication en faisant appel à la capacité de l’ADN polymérase à
synthétiser le brin complémentaire de l’ADN matrice. Pour initier le processus, des amorces
s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN
polymérase de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de
nouveaux ADN doubles brins.
Elle est réalisée dans un mélange réactionnel comprenant :
L’ADN déjà extrait
L’eau distillée
Les amorces sens et revers
Le Mix Green GoTaq : c’est une solution qui contient les dNTP, MgCl 2 , le tampon qui
donne au milieu un pH stable et optimal, deux colorants (bleu de bromophénol et le jaune de
cyanol) et l’ADN polymérase.
Les ADN polymérase utilisées proviennent d’une bactérie extrêmophile (ses conditions de vie sont
mortelle pour la plupart des autres organismes) Thermus aquaticus qui vit dans les sources chaudes
et résiste à des températures de l’ordre de 100°C qui sont généralement suffisantes pour dénaturer la
plupart des protéines. La température optimale pour l’activité de la Taq polymérase est de 72°C.
La PCR est assuré par la répétition d’un cycle comprenant 3 étapes qui sont effectuées à des durées
et températures différentes:
Etape 1 : Dénaturation de l’ADN
Elle s’effectue à 94°C, à cette température, les liaisons hydrogènes entre les bases azotées sont
rompues et l’ADN qui été double brin se dénature en un ADN simple brin (ADN monocaténaire).