Chapitre II : Matériel et méthodes
-29 Méthode CTAB (Cethyl Trimethyl Amonium Bromide): l’extraction en utilisant cette
méthode s’effectue en 6 étapes :
a-Solubilisation du tissu
Afin de détruire le tissu et libérer l’ADN, deux solutions sont ajoutées :
- La solution de lyse qui contient plusieurs composants dont :
o Le détergent CTAB qui disloque la membrane plasmique (protéines membranaire) et donc
facilite la lyse de la cellule.
o Le tampon tris- HCl à pH basique qui permet une meilleure solubilisation de l’ADN.
o Les chlorures de sodium NaCl à 1.4M qui facilite la précipitation de l’ADN le sel permet de
neutraliser les charges de l’ADN qui sont négatives pour que les molécules puissent se
regrouper et se précipiter.
o Un agent chélateur EDTA (Éthylène Diamine Tétra-Acétique) qui chélate les ions divalent
(NaCl 2 et CaCl 2 ) afin de protéger l'ADN des DNAses qui ne sont actives qu’en présence de
ces ions.
-La protéinase K qui est utilisée pour éliminer les protéines associées à l’ADN.
b-Précipitation de protéine
La molécule d’ADN contient des contaminants indésirables qui sont généralement de nature
protéique.
Une solution de chloroforme isoamylol (24,1) est ajoutée pour précipiter ces protéines et purifier la
molécule d’ADN.
Après centrifugation, les contaminent sont dénaturés et accumulés dans la phase organique qui se
retrouve entre deux phases ; la phase chloroformique et la phase aqueuse qui contient l’ADN
(solution de lyse), cette dernière est récupéré et transférée dans un autre tube pour la prochaine
étape.
c-Précipitation de l’ADN
Pour récupérer l’ADN qui se trouve dans la phase aqueuse, il est précipité avec le Na OAC à pH
acide en présence de l’Ethanol à 100%.
Après centrifugation, l’ADN et s’il est en quantité suffisante apparaitra en blanc dans le culot
Le tube est ensuite vidé de la phase aqueuse pour ne garder que le culot.
d-Lavage à l’Ethanol 70%
Ce lavage permet de solubilité les sels précipité avec l’ADN lors de l’opération précédente tout en
gardant ce dernier précipité.
Après centrifugation, la phase aqueuse est éliminée et il ne reste que l’ADN pure dans le culot. Le
tube est ensuite séché au speed vac pour éliminer toute trace d’Ethanol.
e-Redissolution de l’ADN
-29 Méthode CTAB (Cethyl Trimethyl Amonium Bromide): l’extraction en utilisant cette
méthode s’effectue en 6 étapes :
a-Solubilisation du tissu
Afin de détruire le tissu et libérer l’ADN, deux solutions sont ajoutées :
- La solution de lyse qui contient plusieurs composants dont :
o Le détergent CTAB qui disloque la membrane plasmique (protéines membranaire) et donc
facilite la lyse de la cellule.
o Le tampon tris- HCl à pH basique qui permet une meilleure solubilisation de l’ADN.
o Les chlorures de sodium NaCl à 1.4M qui facilite la précipitation de l’ADN le sel permet de
neutraliser les charges de l’ADN qui sont négatives pour que les molécules puissent se
regrouper et se précipiter.
o Un agent chélateur EDTA (Éthylène Diamine Tétra-Acétique) qui chélate les ions divalent
(NaCl 2 et CaCl 2 ) afin de protéger l'ADN des DNAses qui ne sont actives qu’en présence de
ces ions.
-La protéinase K qui est utilisée pour éliminer les protéines associées à l’ADN.
b-Précipitation de protéine
La molécule d’ADN contient des contaminants indésirables qui sont généralement de nature
protéique.
Une solution de chloroforme isoamylol (24,1) est ajoutée pour précipiter ces protéines et purifier la
molécule d’ADN.
Après centrifugation, les contaminent sont dénaturés et accumulés dans la phase organique qui se
retrouve entre deux phases ; la phase chloroformique et la phase aqueuse qui contient l’ADN
(solution de lyse), cette dernière est récupéré et transférée dans un autre tube pour la prochaine
étape.
c-Précipitation de l’ADN
Pour récupérer l’ADN qui se trouve dans la phase aqueuse, il est précipité avec le Na OAC à pH
acide en présence de l’Ethanol à 100%.
Après centrifugation, l’ADN et s’il est en quantité suffisante apparaitra en blanc dans le culot
Le tube est ensuite vidé de la phase aqueuse pour ne garder que le culot.
d-Lavage à l’Ethanol 70%
Ce lavage permet de solubilité les sels précipité avec l’ADN lors de l’opération précédente tout en
gardant ce dernier précipité.
Après centrifugation, la phase aqueuse est éliminée et il ne reste que l’ADN pure dans le culot. Le
tube est ensuite séché au speed vac pour éliminer toute trace d’Ethanol.
e-Redissolution de l’ADN