Chapitre II : Matériel et méthodes
-28en étoile (Saitou et Nei, 1987). Elle a l’avantage d’être rapide et peu traiter plusieurs milliers de
séquences mais son principal défaut est que les différences observées entre les séquences ne
reflètent pas exactement les distances évolutives. Des substitutions multiples sur le même site
peuvent sous-estimer la vraie distance et faire que des séquences soient artificiellement proches
(Holder et Lewis, 2003).
B. Les méthodes basées sur les caractères s'intéressent au nombre de mutations qui affectent
chacun des sites de la séquence, on distingue la méthode de maximum de parcimonie
C. Les méthodes basées sur les caractères et les distances, ce sont des méthodes statistiques
ou probabilistes, elle comprend la méthode du maximum de vraisemblance
4.3.3. Evaluation de la robustesse des arbres phylogénétiques : le test de bootstrap
Cette méthode a été inventée par Bradley Efron en 1979 et introduite en phylogénie par Felsentien
en 1985, elle permet d’estimer la robustesse des nœuds des arbres phylogénétiques.
Le bootstrap procède à un tirage aléatoire avec remise des caractères jusqu’à ce que le nombre de
sites tirés soit identique au nombre de sites du jeu initial de données. Ce tirage est répété plusieurs
fois (en général 1000 fois) afin de générer plusieurs alignements qui permettront de construire
plusieurs arbres. Dans chaque alignement, certains caractères (colonnes) sont représentés plusieurs
fois tandis que d’autres en sont absents. Chaque nœud de l’arbre initial possèdera un pourcentage
qui indique la proportion d’arbres issus du tirage qui le représentent. C’est la valeur de bootstrap
(Lecointre et Le Guyader, 2001).
4.3.4. Enracinement de l’arbre phylogénétique
Les méthodes de reconstitution phylogénétiques aboutissent à des arbres non enracinées. Pour les
enraciner, on peut procéder de deux manières, la première consiste à trouver une espèce
(extragroupe) dont on soit sûr qu’elle est extérieur au groupe d’étude, la seconde suppose que le
taux d’évolution dans les différentes lignées est similaire, la racine sera ensuite placer au point de
l’arbre équidistant à toutes les UTOs et on parle de mid-point rooting (Salemi et Vandamme, 2003).
4.3.5. Principes des techniques de génétique moléculaire
4.3.5.1. Extraction de l’ADN
L’extraction de l’ADN est la première étape dans la plupart des études moléculaires, son objectif est
de séparer la molécule d’ADN de tous les constituants du tissu y compris les molécules qui sont
fortement liées à elle.
Pour cela, deux protocoles ont étaient utilisés, le protocole CTAB et le kit d’extraction Qiagen, ce
dernier permet d’obtenir des résultats dans une période relativement courte par rapport au premier.
-28en étoile (Saitou et Nei, 1987). Elle a l’avantage d’être rapide et peu traiter plusieurs milliers de
séquences mais son principal défaut est que les différences observées entre les séquences ne
reflètent pas exactement les distances évolutives. Des substitutions multiples sur le même site
peuvent sous-estimer la vraie distance et faire que des séquences soient artificiellement proches
(Holder et Lewis, 2003).
B. Les méthodes basées sur les caractères s'intéressent au nombre de mutations qui affectent
chacun des sites de la séquence, on distingue la méthode de maximum de parcimonie
C. Les méthodes basées sur les caractères et les distances, ce sont des méthodes statistiques
ou probabilistes, elle comprend la méthode du maximum de vraisemblance
4.3.3. Evaluation de la robustesse des arbres phylogénétiques : le test de bootstrap
Cette méthode a été inventée par Bradley Efron en 1979 et introduite en phylogénie par Felsentien
en 1985, elle permet d’estimer la robustesse des nœuds des arbres phylogénétiques.
Le bootstrap procède à un tirage aléatoire avec remise des caractères jusqu’à ce que le nombre de
sites tirés soit identique au nombre de sites du jeu initial de données. Ce tirage est répété plusieurs
fois (en général 1000 fois) afin de générer plusieurs alignements qui permettront de construire
plusieurs arbres. Dans chaque alignement, certains caractères (colonnes) sont représentés plusieurs
fois tandis que d’autres en sont absents. Chaque nœud de l’arbre initial possèdera un pourcentage
qui indique la proportion d’arbres issus du tirage qui le représentent. C’est la valeur de bootstrap
(Lecointre et Le Guyader, 2001).
4.3.4. Enracinement de l’arbre phylogénétique
Les méthodes de reconstitution phylogénétiques aboutissent à des arbres non enracinées. Pour les
enraciner, on peut procéder de deux manières, la première consiste à trouver une espèce
(extragroupe) dont on soit sûr qu’elle est extérieur au groupe d’étude, la seconde suppose que le
taux d’évolution dans les différentes lignées est similaire, la racine sera ensuite placer au point de
l’arbre équidistant à toutes les UTOs et on parle de mid-point rooting (Salemi et Vandamme, 2003).
4.3.5. Principes des techniques de génétique moléculaire
4.3.5.1. Extraction de l’ADN
L’extraction de l’ADN est la première étape dans la plupart des études moléculaires, son objectif est
de séparer la molécule d’ADN de tous les constituants du tissu y compris les molécules qui sont
fortement liées à elle.
Pour cela, deux protocoles ont étaient utilisés, le protocole CTAB et le kit d’extraction Qiagen, ce
dernier permet d’obtenir des résultats dans une période relativement courte par rapport au premier.