Chapitre deuxièmes :
Matérielles et méthodes
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 Coloration de Gram :
• coloration primaire : couvrir la lame de violet de gentiane et laisser agir pendant 2
minutes puis jeter l’excès de colorant.
• Mordançage : égoutter sans rincer et faire deux bains de lugol dont chacun durera 45
secondes.
• Décoloration : égoutter et plonger la lame dans de l’alcool 96° durant 30 secondes.
• Coloration secondaire : procéder à une recoloration de la lame avec de la fuchsine
pendant deux minutes.
• laver à l’eau distillée et sécher la lame au-dessus de la flamme
 Observation au microscope :
• après fixation de la lame, observer à l’objectif à immersion (G 100*10), on a :
• les bactéries colorées en violet sont les bactéries dites à Gram +
• les bactéries colorées en rose sont les bactéries dites Gram ─
II.2.7.2. Recherche de la réaction de l’oxydase :
• L’oxydase ou le cytochrome oxydase est une enzyme présente dans certaines chaines
respiratoires cytochromiques bactériennes (Dellaras, 2007).
• La recherche de la réaction de l’oxydase consiste à mettre en évidence la capacité de la
bactérie testée à oxyder la forme réduite incolore de dérivés méthylés du paraphénylène
diamine, en leur forme oxydée semi-quinonique rose violacée (Prescott et al, 2010).
 Mode opératoire :
• Déposer, sur une lame porte-objet propre, un disque «Ox» et l’imbiber avec une goutte
d’eau distillée stérile ou de l’eau physiologique stérile.
• Prélever une partie de la colonie à étudier à l’aide d’une anse préalablement flambée et
l’étaler sur le disque.