Chapitre deuxièmes :
Matérielles et méthodes
25
Pour toutes les cultures sur les différents milieux La coloration de Gram, le test de catalase et
celui de l’oxydase ont été réalisés sur les colonies suspectes. La pureté des souches a été vérifiée
par observation microscopique après une coloration de Gram. Les souches pures de vibrio sont
obtenues par plusieurs repiquages consécutifs. Malheureusement, la forte production de
biofilms synthétisés par Pseudomonas aeruginosa et Aeromonas présumés n’a pas permis la
sélection de colonies bien isolées sur les géloses King A et B et Columbia au sang. Cinq
repiquages successifs n’ont pas abouti à l’isolement de colonies bien distinctes.
Dans le but d’améliorer l’isolement des souches nous les avons repiquées après une dilution
dans de l’eau peptonée. Puis nous avons tenté des ré-isolé par la technique des quadrants. Nous
avons également additionné de l’acide salicylique aux cultures sur bouillon de Pseudomonas
en vue de désintégrer le biofilm et bien séparer les colonies.
II.2.5.1. Essai de l’obtention de souches pures :
Ensemencement en stries par épuisement sur les quatre quadrants :
Avant l’utilisation des boites de Petri, on a procédé à la division de ces dernières en 4 quarts
A l’aide d’une anse préalablement flambée, prélever un fragment de chaque colonie.
L’inoculum est déposé en un point périphérique de la surface du milieu puis il est étalé en stries
serrées sur une moitié de la boite de Pétri (quadrants 1 et 2).La boîte est pivotée d’un quart de
tour. L’anse est flambée sert à faire des stries serrées en partant du 2
eme vers le 3
em
. Après avoir
stérilisé à nouveau la pipette Pasteur, on fait tourner la boîte d’un quart de tour on répète
l’opération en disséminant l’inoculum du 3
eme quadrant vers le 4
eme
.
Les boîtes ensemencées sont placées en position renversée pour éviter la condensation de l’eau
sur le couvercle puis incubées à la température adéquate.
Ensemencement en stries par épuisement après dilution :
Le choix du diluant est fonction du germe recherché. Pour les vibrio de l’eau peptonée alcaline
salé a servi de diluant. Alors que les Pseudomons et les Aeromonas sont dilués dans de l’eau
peptonée tamponnée.
Une parcelle d’une colonie suspecte est diluée dans 10 ml de Diluant puis vortexer. L’agitation
au vortex a pour but de mettre en suspension la colonie prélevée et bien disperser les germes.
Matérielles et méthodes
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Pour toutes les cultures sur les différents milieux La coloration de Gram, le test de catalase et
celui de l’oxydase ont été réalisés sur les colonies suspectes. La pureté des souches a été vérifiée
par observation microscopique après une coloration de Gram. Les souches pures de vibrio sont
obtenues par plusieurs repiquages consécutifs. Malheureusement, la forte production de
biofilms synthétisés par Pseudomonas aeruginosa et Aeromonas présumés n’a pas permis la
sélection de colonies bien isolées sur les géloses King A et B et Columbia au sang. Cinq
repiquages successifs n’ont pas abouti à l’isolement de colonies bien distinctes.
Dans le but d’améliorer l’isolement des souches nous les avons repiquées après une dilution
dans de l’eau peptonée. Puis nous avons tenté des ré-isolé par la technique des quadrants. Nous
avons également additionné de l’acide salicylique aux cultures sur bouillon de Pseudomonas
en vue de désintégrer le biofilm et bien séparer les colonies.
II.2.5.1. Essai de l’obtention de souches pures :
Ensemencement en stries par épuisement sur les quatre quadrants :
Avant l’utilisation des boites de Petri, on a procédé à la division de ces dernières en 4 quarts
A l’aide d’une anse préalablement flambée, prélever un fragment de chaque colonie.
L’inoculum est déposé en un point périphérique de la surface du milieu puis il est étalé en stries
serrées sur une moitié de la boite de Pétri (quadrants 1 et 2).La boîte est pivotée d’un quart de
tour. L’anse est flambée sert à faire des stries serrées en partant du 2
eme vers le 3
em
. Après avoir
stérilisé à nouveau la pipette Pasteur, on fait tourner la boîte d’un quart de tour on répète
l’opération en disséminant l’inoculum du 3
eme quadrant vers le 4
eme
.
Les boîtes ensemencées sont placées en position renversée pour éviter la condensation de l’eau
sur le couvercle puis incubées à la température adéquate.
Ensemencement en stries par épuisement après dilution :
Le choix du diluant est fonction du germe recherché. Pour les vibrio de l’eau peptonée alcaline
salé a servi de diluant. Alors que les Pseudomons et les Aeromonas sont dilués dans de l’eau
peptonée tamponnée.
Une parcelle d’une colonie suspecte est diluée dans 10 ml de Diluant puis vortexer. L’agitation
au vortex a pour but de mettre en suspension la colonie prélevée et bien disperser les germes.