Contribution à la Différenciation Morphométriques et Génétique de Carassin Commun
(Carassius carassius)
Matériels et Méthodes
33
II.5 Extraction de l’ADN à partir de foie congelé
L’extraction de l’ADN est une technique qui isole de l’ADN à partir d’une cellule en quantité
et en qualité suffisante pour permettre son analyse.
Classiquement, les principales étapes de cette technique sont les suivantes :
A. Destruction des tissus afin de libérer l’ADN du noyau
Disséquer les poissons, et prélever le foie puis peser chaque échantillon à l’aide d’une
balance de précision (prendre la même quantité du foie dans tous les échantillons).
Les échantillons sont broyés dans un mortier à l'aide de piston et mis en solution pour
permettre l’homogénéisation des tissus et la solubilisation des cellules.
Afin de lyser (détruire) les tissus et les cellules ; On rajoute du tampon à l'urée (Urée
8M, Tris 1M, EDTA 0.5M, Na Cl 5M, Acétate de Sodium 3M) à raison de 6ml pour lg
d'échantillon, qui permettent la dissolution des lipides des membranes cellulaires et
leur solubilisation.
Le mélange est transvasé dans des tubes coniques de 50ml puis ajouter 150μ1 de
protéinase K (20 mg/ml), cette enzyme hydrolyse les protéines (coupure des liaisons
peptidiques…).
La préparation est agitée sur le rotor pendant 20 minutes puis les tubes coniquessont
incubés toute la nuit dans l’étuve à 56°C. Au cours de cette étape, l'enzyme va digérer
les protéines contenues dans la cellule, et notamment celles qui sont liées à l’ADN.
B. Elimination des protéines et des peptides
Ajouter 5 ml de solution de phénol-chloroforme à chaque tube et agiter manuellement
pendant 10 minutes, Mélanger par retournements successifs afin de faire précipiter les
protéines qui se ressemblent sous une forme insoluble, l’ADN reste en solution dans
la phase aqueuse qui est récupérée par centrifugation.
Le mélange est centrifugé à 2500 tr/mn pendant 10 mn (Équilibrer soigneusement les
tubes et centrifuger), la force centrifugeuse va séparer les constituants du mélange
selon leurs densités,les débris cellulaires s'accumulent au fond du tube en un culot, la
solution contenant l'ADN dissous forme le surnageant.
Récupérer le surnageant et le transférer dans un tube conique propre de 50ml.
C. Précipitation de l'ADN et purification
Ajouter au surnageant 2.5v de l'éthanol absolu et 1/10de l’acétate de sodium(par
rapport au volume de l’échantillon) afin de précipiter les acides nucléiques.
(Carassius carassius)
Matériels et Méthodes
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II.5 Extraction de l’ADN à partir de foie congelé
L’extraction de l’ADN est une technique qui isole de l’ADN à partir d’une cellule en quantité
et en qualité suffisante pour permettre son analyse.
Classiquement, les principales étapes de cette technique sont les suivantes :
A. Destruction des tissus afin de libérer l’ADN du noyau
Disséquer les poissons, et prélever le foie puis peser chaque échantillon à l’aide d’une
balance de précision (prendre la même quantité du foie dans tous les échantillons).
Les échantillons sont broyés dans un mortier à l'aide de piston et mis en solution pour
permettre l’homogénéisation des tissus et la solubilisation des cellules.
Afin de lyser (détruire) les tissus et les cellules ; On rajoute du tampon à l'urée (Urée
8M, Tris 1M, EDTA 0.5M, Na Cl 5M, Acétate de Sodium 3M) à raison de 6ml pour lg
d'échantillon, qui permettent la dissolution des lipides des membranes cellulaires et
leur solubilisation.
Le mélange est transvasé dans des tubes coniques de 50ml puis ajouter 150μ1 de
protéinase K (20 mg/ml), cette enzyme hydrolyse les protéines (coupure des liaisons
peptidiques…).
La préparation est agitée sur le rotor pendant 20 minutes puis les tubes coniquessont
incubés toute la nuit dans l’étuve à 56°C. Au cours de cette étape, l'enzyme va digérer
les protéines contenues dans la cellule, et notamment celles qui sont liées à l’ADN.
B. Elimination des protéines et des peptides
Ajouter 5 ml de solution de phénol-chloroforme à chaque tube et agiter manuellement
pendant 10 minutes, Mélanger par retournements successifs afin de faire précipiter les
protéines qui se ressemblent sous une forme insoluble, l’ADN reste en solution dans
la phase aqueuse qui est récupérée par centrifugation.
Le mélange est centrifugé à 2500 tr/mn pendant 10 mn (Équilibrer soigneusement les
tubes et centrifuger), la force centrifugeuse va séparer les constituants du mélange
selon leurs densités,les débris cellulaires s'accumulent au fond du tube en un culot, la
solution contenant l'ADN dissous forme le surnageant.
Récupérer le surnageant et le transférer dans un tube conique propre de 50ml.
C. Précipitation de l'ADN et purification
Ajouter au surnageant 2.5v de l'éthanol absolu et 1/10de l’acétate de sodium(par
rapport au volume de l’échantillon) afin de précipiter les acides nucléiques.