Matériel et méthodes
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- Laisser refroidir.
➢ Coloration différentielle :
- Inonder le frottis séché à l'air et fixé à la chaleur pendant 1 minute avec le réactif
de coloration au cristal violet. Veuillez noter que la qualité du frottis
(concentration cellulaire trop lourde ou trop légère) affectera les résultats de la
coloration.
- Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes ;
- Inonder avec le mordant : iode ou Lugol. Attendez 1 minute ;
- Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes ;
- Inonder la lame avec agent décolorant. Attendre 15 secondes ou ajouter goutte à
goutte pour faire sortir l’agent de décoloration ;
- Inonder la lame avec contre-colorant, « safranine ». Patienter 30 secondes à 1
minute puis laver la lame dans un jet d'eau douce et indirecte de l'eau du robinet
jusqu'à ce qu'aucune couleur n'apparaisse dans l'effluent, puis sécher avec du
papier absorbant, finalement observez les résultats de la procédure de coloration
sous immersion dans l'huile puis examiner au microscope, objectif x100.
À la fin, les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge et les bactéries à Gram positif
tacheront le bleu / violet.
• Test de catalase :
▪ Principe :
La catalase est une enzyme qui catalyse la dégradation de du peroxyde d'hydrogène à l'eau et
à l'oxygène moléculaire (H2O2 → H2O + O2). Les organismes catalase-positifs produisent
rapidement des bulles lorsqu'il est exposé à une solution contenant du peroxyde d'hydrogène.
(HARVEY & al, 2007).
▪ Mode opératoire :
À partir de la croissance présente sur la gélose de Baird Parker :
- Dans une zone aseptique prélever avec une anse de platine stérile une colonie
bien isolée.
- Sur une lame en verre ajouter 1 ou 2 gouttes de la solution de peroxyde
d’hydrogène à 3 %.
- Déposer la colonie sur la lame au niveau des gouttes de la solution de peroxyde
d’hydrogène.
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- Laisser refroidir.
➢ Coloration différentielle :
- Inonder le frottis séché à l'air et fixé à la chaleur pendant 1 minute avec le réactif
de coloration au cristal violet. Veuillez noter que la qualité du frottis
(concentration cellulaire trop lourde ou trop légère) affectera les résultats de la
coloration.
- Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes ;
- Inonder avec le mordant : iode ou Lugol. Attendez 1 minute ;
- Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes ;
- Inonder la lame avec agent décolorant. Attendre 15 secondes ou ajouter goutte à
goutte pour faire sortir l’agent de décoloration ;
- Inonder la lame avec contre-colorant, « safranine ». Patienter 30 secondes à 1
minute puis laver la lame dans un jet d'eau douce et indirecte de l'eau du robinet
jusqu'à ce qu'aucune couleur n'apparaisse dans l'effluent, puis sécher avec du
papier absorbant, finalement observez les résultats de la procédure de coloration
sous immersion dans l'huile puis examiner au microscope, objectif x100.
À la fin, les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge et les bactéries à Gram positif
tacheront le bleu / violet.
• Test de catalase :
▪ Principe :
La catalase est une enzyme qui catalyse la dégradation de du peroxyde d'hydrogène à l'eau et
à l'oxygène moléculaire (H2O2 → H2O + O2). Les organismes catalase-positifs produisent
rapidement des bulles lorsqu'il est exposé à une solution contenant du peroxyde d'hydrogène.
(HARVEY & al, 2007).
▪ Mode opératoire :
À partir de la croissance présente sur la gélose de Baird Parker :
- Dans une zone aseptique prélever avec une anse de platine stérile une colonie
bien isolée.
- Sur une lame en verre ajouter 1 ou 2 gouttes de la solution de peroxyde
d’hydrogène à 3 %.
- Déposer la colonie sur la lame au niveau des gouttes de la solution de peroxyde
d’hydrogène.