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Le séquençage de l’ADN consiste à déterminer la séquence nucléotidique d’un gène ou d’un
fragment de gène, ce procédé repose sur la synthèse d’un brin d’ADN par une ADN
polymérase, il a été mis au point pour la première fois en 1977.
L’ADN à séquencer est appelé ADN matrice, il doit être obtenu sous forme purifié et être
homogène (il ne doit contenir que des molécules d’ADN ayant la même séquence). On utilise
couramment comme matrice de l’ADN cloné ou produit par PCR. Cet ADN simple brin est
obtenu par dénaturation de la matrice d’ADN double brin via un traitement thermique ou
alcalin (WINTER P.C et al, 2000).
Pour le séquençage on utilise de nombreuses ADN polymérases: fragment de Klenow (une
partie de l’ADN polymérase I d’E. coli), une ADN polymérase modifiée tirée du phage T
appelée la séquenase et la Taq ADN polymérase qui est aussi utilisée en PCR.
Les étapes de séquençage
On prépare 4 milieux réactionnels différents. Tous contiennent: l’ADN matrice sous forme
simple brin, de l’ADN polymérase, des amorces, les 4 désoxyribonucléotides triphosphates
(dNTP), souvent sont les briques nécessaires à la construction du nouvel ADN. Chacun
contient un nucléotide modifié différent, appelé un didésoxyribonucléotide (ddNTP).
L’utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes
tailles correspondant à l’emplacement d'un nucléotide donné.
Il y a 4 ddNTP qui correspondent aux 4 bases de l’ADN. Ils diffèrent des dNTP par l’absence
de groupe hydroxyle sur le carbone 3’ du sucre. Ils sont incorporés à l’ADN en croissance
par la polymérase, mais cette absence de l’hydroxyle en 3’ empêche de former un lien
phosphodiester avec le nucléotide qui devrait être ajouté ensuite, ceci interdit de poursuivre
l’élongation du polynucléotide d’ADN en cours de synthèse.
Les ddNTP jouent ainsi le rôle d’inhibiteurs de la synthèse de l’ADN.
Chacun des 4 milieux réactionnels préparés pour le séquençage contient un ddNTP différent.
Suivant le ddNTP qui est présent, la synthèse se termine à l’endroit ou ce nucléotide modifié
est incorporé.
À tout moment, durant la synthèse d’ADN, la polymérase peut incorporer à la chaîne en
élongation soit un dNTP soit un ddNTP.
Dans le premier cas, la synthèse continue tandis que dans le second, la synthèse s’achève en
cette position.
Le séquençage de l’ADN consiste à déterminer la séquence nucléotidique d’un gène ou d’un
fragment de gène, ce procédé repose sur la synthèse d’un brin d’ADN par une ADN
polymérase, il a été mis au point pour la première fois en 1977.
L’ADN à séquencer est appelé ADN matrice, il doit être obtenu sous forme purifié et être
homogène (il ne doit contenir que des molécules d’ADN ayant la même séquence). On utilise
couramment comme matrice de l’ADN cloné ou produit par PCR. Cet ADN simple brin est
obtenu par dénaturation de la matrice d’ADN double brin via un traitement thermique ou
alcalin (WINTER P.C et al, 2000).
Pour le séquençage on utilise de nombreuses ADN polymérases: fragment de Klenow (une
partie de l’ADN polymérase I d’E. coli), une ADN polymérase modifiée tirée du phage T
appelée la séquenase et la Taq ADN polymérase qui est aussi utilisée en PCR.
Les étapes de séquençage
On prépare 4 milieux réactionnels différents. Tous contiennent: l’ADN matrice sous forme
simple brin, de l’ADN polymérase, des amorces, les 4 désoxyribonucléotides triphosphates
(dNTP), souvent sont les briques nécessaires à la construction du nouvel ADN. Chacun
contient un nucléotide modifié différent, appelé un didésoxyribonucléotide (ddNTP).
L’utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes
tailles correspondant à l’emplacement d'un nucléotide donné.
Il y a 4 ddNTP qui correspondent aux 4 bases de l’ADN. Ils diffèrent des dNTP par l’absence
de groupe hydroxyle sur le carbone 3’ du sucre. Ils sont incorporés à l’ADN en croissance
par la polymérase, mais cette absence de l’hydroxyle en 3’ empêche de former un lien
phosphodiester avec le nucléotide qui devrait être ajouté ensuite, ceci interdit de poursuivre
l’élongation du polynucléotide d’ADN en cours de synthèse.
Les ddNTP jouent ainsi le rôle d’inhibiteurs de la synthèse de l’ADN.
Chacun des 4 milieux réactionnels préparés pour le séquençage contient un ddNTP différent.
Suivant le ddNTP qui est présent, la synthèse se termine à l’endroit ou ce nucléotide modifié
est incorporé.
À tout moment, durant la synthèse d’ADN, la polymérase peut incorporer à la chaîne en
élongation soit un dNTP soit un ddNTP.
Dans le premier cas, la synthèse continue tandis que dans le second, la synthèse s’achève en
cette position.