ADN tumoral circulant 153
produit un signal fluorescent positif ou négatif indiquant si la mutation
cible est présente ou non. Le nombre de gouttelettes positives et négatives dans chaque puits est utilisé pour calculer la concentration de la
séquence d’intérêt. Les gouttelettes positives et négatives sont comptées
dans l’échantillon puis un logiciel calcule la concentration d’ADN en
copies par mL [25-27].
• La raindrop digital PCR (Raindance) est une technique de PCR digitale
qui permet la détection d’allèles tumoraux peu fréquents. Il s’agit d’une
technique sensible, spécifique qui permet une détection quantitative des
mutations. Elle utilise des marqueurs de couleurs et d’intensités différentes
permettant la détection de mutations spécifiques. Cette technique génère
1 à 10 millions de gouttelettes de taille de l’ordre du picolitre, ce qui est
500 à 10 000 fois plus performant que les autres techniques. Chaque
gouttelette contient une molécule d’ADN. Cette technique mesure le
ratio des gouttelettes présentant une mutation spécifique aux gouttelettes ne contenant que de l’ADN sauvage. Quatre-vingt mille réactions
de PCR par seconde par gouttelette sont réalisées simultanément. Cette
PCR en émulsion fait appel à des sondes Taqman® spécifiques des gènes
mutés et non mutés en présence d’amorces et de l’échantillon d’ADN.
Les sondes spécifiques sont conjuguées à un fluorophore qui générera un
signal fluorescent [28-31].
Cette technique se réalise en trois grandes étapes : mise en émulsion, puis
recueil de l’émulsion dans un tube PDMS (polydiméthylsiloxane) scellé
(dispositif de collecte et de réinjection), thermocyclage de l’émulsion pour
effectuer la PCR, puis dépôt sur un dispositif microfluidique. Au cours
de l’amplification, les sondes Taqman® sont clivées et le fluororophore est
libéré. L’amplification de l’ADN non muté génère un signal rouge fluorescent et celle de l’ADN muté un signal vert fluorescent. L’émulsion est
ensuite réinjectée sur une puce microfluidique et les gouttelettes sont espacées par une solution huileuse, le signal fluorescent de chaque gouttelette
est analysé avec calcul du ratio muté/non muté. Une fluorescence jaune est
générée par les gouttelettes contenant de l’ADN à la fois muté et non muté,
l’absence de fluorescence quant à elle est due à l’absence d’ADN. Cette
technique présente de nombreux avantages, notamment une très bonne
sensibilité. Elle peut détecter 1 mutant parmi 250 000 molécules de type
sauvage avec une limite inférieure de détection de 1 à plus de 1 000 000.
C’est une technique en multiplexage qui permet donc de réaliser simultanément l’analyse de 10 mutations [28-31]. La réaction a lieu en tube fermé
afin d’assurer la meilleure qualité en éliminant les risques de contamination
[28-31].
• La méthode Intplex est une Q-PCR spécifique d’allèle qui permet la
x
détection de mutation et la détermination de la concentration d’ADN
circulant [6]. Elle utilise un bloqueur spécifique d’allèle qui empêche
l’amplification des séquences non mutées. Elle prend en compte la taille
produit un signal fluorescent positif ou négatif indiquant si la mutation
cible est présente ou non. Le nombre de gouttelettes positives et négatives dans chaque puits est utilisé pour calculer la concentration de la
séquence d’intérêt. Les gouttelettes positives et négatives sont comptées
dans l’échantillon puis un logiciel calcule la concentration d’ADN en
copies par mL [25-27].
• La raindrop digital PCR (Raindance) est une technique de PCR digitale
qui permet la détection d’allèles tumoraux peu fréquents. Il s’agit d’une
technique sensible, spécifique qui permet une détection quantitative des
mutations. Elle utilise des marqueurs de couleurs et d’intensités différentes
permettant la détection de mutations spécifiques. Cette technique génère
1 à 10 millions de gouttelettes de taille de l’ordre du picolitre, ce qui est
500 à 10 000 fois plus performant que les autres techniques. Chaque
gouttelette contient une molécule d’ADN. Cette technique mesure le
ratio des gouttelettes présentant une mutation spécifique aux gouttelettes ne contenant que de l’ADN sauvage. Quatre-vingt mille réactions
de PCR par seconde par gouttelette sont réalisées simultanément. Cette
PCR en émulsion fait appel à des sondes Taqman® spécifiques des gènes
mutés et non mutés en présence d’amorces et de l’échantillon d’ADN.
Les sondes spécifiques sont conjuguées à un fluorophore qui générera un
signal fluorescent [28-31].
Cette technique se réalise en trois grandes étapes : mise en émulsion, puis
recueil de l’émulsion dans un tube PDMS (polydiméthylsiloxane) scellé
(dispositif de collecte et de réinjection), thermocyclage de l’émulsion pour
effectuer la PCR, puis dépôt sur un dispositif microfluidique. Au cours
de l’amplification, les sondes Taqman® sont clivées et le fluororophore est
libéré. L’amplification de l’ADN non muté génère un signal rouge fluorescent et celle de l’ADN muté un signal vert fluorescent. L’émulsion est
ensuite réinjectée sur une puce microfluidique et les gouttelettes sont espacées par une solution huileuse, le signal fluorescent de chaque gouttelette
est analysé avec calcul du ratio muté/non muté. Une fluorescence jaune est
générée par les gouttelettes contenant de l’ADN à la fois muté et non muté,
l’absence de fluorescence quant à elle est due à l’absence d’ADN. Cette
technique présente de nombreux avantages, notamment une très bonne
sensibilité. Elle peut détecter 1 mutant parmi 250 000 molécules de type
sauvage avec une limite inférieure de détection de 1 à plus de 1 000 000.
C’est une technique en multiplexage qui permet donc de réaliser simultanément l’analyse de 10 mutations [28-31]. La réaction a lieu en tube fermé
afin d’assurer la meilleure qualité en éliminant les risques de contamination
[28-31].
• La méthode Intplex est une Q-PCR spécifique d’allèle qui permet la
x
détection de mutation et la détermination de la concentration d’ADN
circulant [6]. Elle utilise un bloqueur spécifique d’allèle qui empêche
l’amplification des séquences non mutées. Elle prend en compte la taille