152 Les biomarqueurs moléculaires en oncologie
Depuis une dizaine d’années, de nombreuses techniques de diagnostic moléculaire ultrasensibles destinées à l’analyse de l’ADN tumoral circulant ont fait leur
apparition sur le marché, parmi lesquelles nous pouvons citer la digital PCR,
la droplet digital PCR (BioRad®, Marnes-la-Coquette, France), le beaming
(Sysmex®, Kobe, Japan), la raindrop digital PCR (RainDance®, Billerica, Étatsg
Unis) et la méthode Intplex (INSERM, Montpellier, France). Toutes ces technologies permettent la détection et l’énumération de variations génétiques à
partir d’ADN tumoral circulant (Tableau I).
• Le beaming (beads, emulsion, amplification and magnetics) (Sysmex®) est
une technique réalisée en quatre étapes : pré-amplification, PCR en émulsion, hybridation et cytométrie de flux. Il s’agit d’une technique de PCR
sur molécule d’ADN fixée sur bille magnétique sur lesquelles se trouvent
les amorces spécifiques du gène d’intérêt. La PCR est réalisée sur les billes
en émulsion. Des sondes fluorescentes marquées spécifiques de la séquence
sauvage ou de la mutation sont ensuite ajoutées et s’hybrident à l’ADN
amplifié. La dernière étape de la technique consiste en la détection de la
fluorescence par cytométrie de flux et donc en la quantification du nombre
de billes contenant de l’ADN muté. Le seuil de détection d’ADN circulant
est de 0,01 % [7, 11, 16, 19-21].
• La digital PCR est une approche offrant une plus grande sensibilité et
R
spécificité en comparaison à la PCR temps réel. Elle permet la détection
d’un allèle cible à partir d’une faible quantité d’un échantillon en utilisant des quantités de réactifs plus faibles que la PCR conventionnelle. Elle
permet la détection d’une copie par population. Cette technique nécessite
au préalable l’isolement de molécules d’ADN par répartition de l’échantillon dans de multiples puits selon la méthode de dilution ultime. Une fois
chaque molécule d’ADN isolée, une PCR est réalisée dans chaque puits.
Chaque puits contient in fine une seule molécule d’ADN, c’est-à-dire que
e
chaque puits contient zéro ou une copie de la séquence d’intérêt, d’où
l’appellation « digitale » en comparaison à l’aspect binaire de l’approche
[22-24].
Cette technique permet l’identification des portions portant la mutation
(positif ) et des portions ne portant pas l’anomalie recherchée (négatif ).
Ainsi, à l’issue des réactions de PCR, le nombre de copies d’un allèle cible
correspond au nombre de puits dans lesquels on peut détecter un signal de
fluorescence.
L’étude du rapport négatif/positif permet également de déterminer un
nombre de copies d’ADN mutés, sans avoir recours à des contrôles internes
[22-24].
• La droplet digital PCR. L’échantillon à analyser est émulsionné et réparti
dans 20 000 gouttelettes contenant la cible d’intérêt et l’ADN non muté,
distribués au hasard dans les gouttelettes. Ces gouttelettes sont ensuite
transférées sur une plaque de 96 puits et l’amplification a lieu à l’aide
d’un thermocycleur classique. Après amplification, chaque gouttelette
Depuis une dizaine d’années, de nombreuses techniques de diagnostic moléculaire ultrasensibles destinées à l’analyse de l’ADN tumoral circulant ont fait leur
apparition sur le marché, parmi lesquelles nous pouvons citer la digital PCR,
la droplet digital PCR (BioRad®, Marnes-la-Coquette, France), le beaming
(Sysmex®, Kobe, Japan), la raindrop digital PCR (RainDance®, Billerica, Étatsg
Unis) et la méthode Intplex (INSERM, Montpellier, France). Toutes ces technologies permettent la détection et l’énumération de variations génétiques à
partir d’ADN tumoral circulant (Tableau I).
• Le beaming (beads, emulsion, amplification and magnetics) (Sysmex®) est
une technique réalisée en quatre étapes : pré-amplification, PCR en émulsion, hybridation et cytométrie de flux. Il s’agit d’une technique de PCR
sur molécule d’ADN fixée sur bille magnétique sur lesquelles se trouvent
les amorces spécifiques du gène d’intérêt. La PCR est réalisée sur les billes
en émulsion. Des sondes fluorescentes marquées spécifiques de la séquence
sauvage ou de la mutation sont ensuite ajoutées et s’hybrident à l’ADN
amplifié. La dernière étape de la technique consiste en la détection de la
fluorescence par cytométrie de flux et donc en la quantification du nombre
de billes contenant de l’ADN muté. Le seuil de détection d’ADN circulant
est de 0,01 % [7, 11, 16, 19-21].
• La digital PCR est une approche offrant une plus grande sensibilité et
R
spécificité en comparaison à la PCR temps réel. Elle permet la détection
d’un allèle cible à partir d’une faible quantité d’un échantillon en utilisant des quantités de réactifs plus faibles que la PCR conventionnelle. Elle
permet la détection d’une copie par population. Cette technique nécessite
au préalable l’isolement de molécules d’ADN par répartition de l’échantillon dans de multiples puits selon la méthode de dilution ultime. Une fois
chaque molécule d’ADN isolée, une PCR est réalisée dans chaque puits.
Chaque puits contient in fine une seule molécule d’ADN, c’est-à-dire que
e
chaque puits contient zéro ou une copie de la séquence d’intérêt, d’où
l’appellation « digitale » en comparaison à l’aspect binaire de l’approche
[22-24].
Cette technique permet l’identification des portions portant la mutation
(positif ) et des portions ne portant pas l’anomalie recherchée (négatif ).
Ainsi, à l’issue des réactions de PCR, le nombre de copies d’un allèle cible
correspond au nombre de puits dans lesquels on peut détecter un signal de
fluorescence.
L’étude du rapport négatif/positif permet également de déterminer un
nombre de copies d’ADN mutés, sans avoir recours à des contrôles internes
[22-24].
• La droplet digital PCR. L’échantillon à analyser est émulsionné et réparti
dans 20 000 gouttelettes contenant la cible d’intérêt et l’ADN non muté,
distribués au hasard dans les gouttelettes. Ces gouttelettes sont ensuite
transférées sur une plaque de 96 puits et l’amplification a lieu à l’aide
d’un thermocycleur classique. Après amplification, chaque gouttelette