chimiques ou enzymatiques. Le clivage de l’ADN se fait au moyen d’enzymes appelées
endonucléases de restriction. Ces enzymes (il en existe plus de 200 variétés) peuvent
couper l’ADN au niveau de séquences de nucléotides spéci?ques appelées « sites de
restriction ». La plupart de ces enzymes reconnaissent des séquences de palindromes,
c’est-à-dire des séquences qui se lisent de façon identique de gauche à droite et de
droite à gauche (les mots « kayak » et « radar » sont des exemples de palindromes). Par
exemple, l’enzyme HaeIII clive les deux brins d’ADN chaque fois qu’elle rencontre la
séquence GGCC dans le brin sens. Le tableau 7.2 présente quelques endonucléases de
restriction et leur spéci?cité.
Tableau 7.2 Quelques endonucléases de restriction
et leur séquence de reconnaissance
Enzyme
Séquence reconnue
HaeIII
5′-GG↓CC-3′
3′-CC↓GG-5′
BamHI
5′-G↓GATCC-3′
3′-CCTAG↓G-5′
EcoRI
5′-G↓AATTC-3′
3′-CTTAA↓G-5′
Les fragments obtenus avec les enzymes de restriction peuvent ensuite être séquencés par la méthode de Sanger
7 , aussi appelée méthode didésoxy, qui consiste à synthétiser une gamme de brins d’ADN complémentaires au fragment original.
Dans la méthode de Sanger, le brin d’ADN à séquencer est mélangé avec les ingrédients nécessaires à la synthèse de l’ADN : les quatre nucléotides standard (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), l’ADN polymérase et une amorce d’ADN, un petit fragment
d’ADN dont la séquence est complémentaire à l’extrémité 3′ du brin d’ADN à séquencer. Une faible quantité de 2′,3′-didésoxynucléotide triphosphate (DDNTP) (voir la
?gure 7.25) est aussi ajoutée au mélange, chacun des quatre didésoxynucléotides étant
marqués par un colorant uorescent différent.
Figure 7.25
Structure d’un
didésoxynucléotide triphosphate
330 Chapitre 7 Acides nucléiques