Les brins d’ADN complémentaires au fragment à séquencer sont synthétisés à partir de l’amorce : les nucléotides sont incorporés aux fragments d’ADN en croissance,
jusqu’à l’incorporation aléatoire d’un didésoxynucléotide. Ce dernier étant dépourvu
d’un groupe hydroxyle en 3′, son incorporation sur une chaîne d’ADN rend l’ajout d’un
autre nucléotide impossible, terminant ainsi la synthèse du fragment. Des chaînes de
différentes longueurs sont alors synthétisées, chacune d’elles se terminant par l’un des
quatre didésoxynucléotides colorés (voir la ?gure 7.26). Les chaînes sont ensuite soumises à une électrophorèse qui permet une séparation des fragments en fonction de
leur taille et de leur charge (nombre de groupes phosphates à charge négative qu’ils
contiennent) (voir la section 6.3.3, p. 263), puis à un détecteur de uorescence a?n de
distinguer les didésoxynucléotides utilisés (voir la ?gure 7.27), ce qui permet d’obtenir
la séquence du brin complémentaire au brin d’origine.
Figure 7.26 Séquençage de l’ADN : synthèse de brins complémentaires
par la méthode didésoxy
Les DDNTP peuvent aussi être marqués par radioactivité (
32 P). Le résultat obtenu
est une autoradiographie. Cette méthode est de moins en moins utilisée, car elle ne
permet que l’incorporation d’un seul DDNTP à la fois. Il faut donc répéter le pro cessus
pour chacun des quatre DDNTP.
Figure 7.27
a) Autoradiographie obtenue
avec le
32 P ; b) Résultat obtenu
avec des colorants ?uorescents
a)
b)
7.6 Séquençage de l’ADN
331
jusqu’à l’incorporation aléatoire d’un didésoxynucléotide. Ce dernier étant dépourvu
d’un groupe hydroxyle en 3′, son incorporation sur une chaîne d’ADN rend l’ajout d’un
autre nucléotide impossible, terminant ainsi la synthèse du fragment. Des chaînes de
différentes longueurs sont alors synthétisées, chacune d’elles se terminant par l’un des
quatre didésoxynucléotides colorés (voir la ?gure 7.26). Les chaînes sont ensuite soumises à une électrophorèse qui permet une séparation des fragments en fonction de
leur taille et de leur charge (nombre de groupes phosphates à charge négative qu’ils
contiennent) (voir la section 6.3.3, p. 263), puis à un détecteur de uorescence a?n de
distinguer les didésoxynucléotides utilisés (voir la ?gure 7.27), ce qui permet d’obtenir
la séquence du brin complémentaire au brin d’origine.
Figure 7.26 Séquençage de l’ADN : synthèse de brins complémentaires
par la méthode didésoxy
Les DDNTP peuvent aussi être marqués par radioactivité (
32 P). Le résultat obtenu
est une autoradiographie. Cette méthode est de moins en moins utilisée, car elle ne
permet que l’incorporation d’un seul DDNTP à la fois. Il faut donc répéter le pro cessus
pour chacun des quatre DDNTP.
Figure 7.27
a) Autoradiographie obtenue
avec le
32 P ; b) Résultat obtenu
avec des colorants ?uorescents
a)
b)
7.6 Séquençage de l’ADN
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