6.7.3.2 Détermination de l’acide aminé C-terminal
Bien qu’il existe plusieurs méthodes chimiques pour déterminer la nature de l’acide
aminé N-terminal, il n’existe pas
5 de méthode chimique aussi éprouvée pour faire la
même analyse du côté C-terminal.
Des méthodes enzymatiques, à l’aide de peptidases, sont plutôt utilisées. En effet,
la carboxypeptidase Y brise de façon sélective la liaison peptidique de l’acide aminé
C-terminal et permet la libération (et l’identi?cation) de celui-ci. Ce clivage enzymatique continue toutefois de s’effectuer sur le peptide restant. En effectuant cette hydrolyse à partir d’une enzyme immobilisée sur une colonne et en choisissant judicieusement
les conditions expérimentales, l’acide aminé C-terminal sortira de la colonne en premier, suivi du deuxième, puis du troisième, etc. La séquence des résidus d’acides aminés
à partir de l’acide aminé C-terminal peut ainsi être déterminée, mais elle se limite à un
certain nombre de cycles. Cette méthode est donc complémentaire à la dégradation
d’Edman du côté N-terminal.
Exemple 6.9
Déterminez les produits obtenus (après un cycle de réaction) à la suite de l’action des réactifs suivants sur le
peptide AspOProOHisOGlyOPhe.
a) Réactif de Sanger ;
b) Réactif d’Edman ;
c) Carboxypeptidase Y.
Solution
a) L’acide aminé N-terminal (Asp) et le résidu de l’acide aminé basique (His) deviennent des dérivés DNP jaunes : tous les
autres sont relâchés comme acides aminés non dérivés. DNPOAsp, DNPOHis, Gly, Pro, Phe
b) L’acide aminé N-terminal (Asp) est transformé en dérivé phénylthiohydantoïne (PTH), et le reste de la chaîne peptidique est
intact. AspOPTH + ProOHisOGlyOPhe
c) La carboxypeptidase brise en premier la liaison peptidique impliquant l’acide aminé C-terminal (Phe) : celui-ci est donc
libéré, laissant le reste de la chaîne peptidique intacte. AspOProOHisOGly + Phe
6.7.3.3 Clivage sélectif de liaisons peptidiques
En raison de leurs limitations, les techniques décrites jusqu’à présent (dégradation
d’Edman et utilisation d’enzymes peptidases) ne peuvent être utilisées pour déterminer la séquence d’acides aminés de protéines ou de peptides de grande taille. Pour
ces macromolécules, il est préférable d’effectuer plutôt une hydrolyse partielle a?n de
briser la chaîne peptidique en plus petits fragments ; ces derniers pourront être isolés
et analysés plus facilement par la suite. Après avoir déterminé la séquence des résidus
d’acides aminés pour chacun des fragments isolés, il devient alors possible, par chevauchement, de reconstituer la séquence complète du polypeptide de départ.
Deux enzymes et un réactif chimique sont souvent utilisés pour hydrolyser
certaines liaisons peptidiques de façon spéci?que. Ces agents de clivage sont les
enzymes trypsine et chymotrypsine, ainsi que le cyanure de brome, aussi appelé
« bromure de cyanogène ». Le tableau 6.4 décrit la spéci?cité de clivage pour chacun
de ces agents.
Tableau 6.4 Enzymes ou réactifs utilisés pour le clivage sélectif
des polypeptides
Agent utilisé
Site de clivage
trypsine
Extrémité carboxylée (à droite) de Arg (R) et Lys (K)
chymotrypsine
Extrémité carboxylée (à droite) de Phe (F), Trp (W) et Tyr (Y)
cyanure de brome (BrCN)
Extrémité carboxylée (à droite) de Met (M)
6.7 Propriétés physiques des peptides et des protéines
279
Bien qu’il existe plusieurs méthodes chimiques pour déterminer la nature de l’acide
aminé N-terminal, il n’existe pas
5 de méthode chimique aussi éprouvée pour faire la
même analyse du côté C-terminal.
Des méthodes enzymatiques, à l’aide de peptidases, sont plutôt utilisées. En effet,
la carboxypeptidase Y brise de façon sélective la liaison peptidique de l’acide aminé
C-terminal et permet la libération (et l’identi?cation) de celui-ci. Ce clivage enzymatique continue toutefois de s’effectuer sur le peptide restant. En effectuant cette hydrolyse à partir d’une enzyme immobilisée sur une colonne et en choisissant judicieusement
les conditions expérimentales, l’acide aminé C-terminal sortira de la colonne en premier, suivi du deuxième, puis du troisième, etc. La séquence des résidus d’acides aminés
à partir de l’acide aminé C-terminal peut ainsi être déterminée, mais elle se limite à un
certain nombre de cycles. Cette méthode est donc complémentaire à la dégradation
d’Edman du côté N-terminal.
Exemple 6.9
Déterminez les produits obtenus (après un cycle de réaction) à la suite de l’action des réactifs suivants sur le
peptide AspOProOHisOGlyOPhe.
a) Réactif de Sanger ;
b) Réactif d’Edman ;
c) Carboxypeptidase Y.
Solution
a) L’acide aminé N-terminal (Asp) et le résidu de l’acide aminé basique (His) deviennent des dérivés DNP jaunes : tous les
autres sont relâchés comme acides aminés non dérivés. DNPOAsp, DNPOHis, Gly, Pro, Phe
b) L’acide aminé N-terminal (Asp) est transformé en dérivé phénylthiohydantoïne (PTH), et le reste de la chaîne peptidique est
intact. AspOPTH + ProOHisOGlyOPhe
c) La carboxypeptidase brise en premier la liaison peptidique impliquant l’acide aminé C-terminal (Phe) : celui-ci est donc
libéré, laissant le reste de la chaîne peptidique intacte. AspOProOHisOGly + Phe
6.7.3.3 Clivage sélectif de liaisons peptidiques
En raison de leurs limitations, les techniques décrites jusqu’à présent (dégradation
d’Edman et utilisation d’enzymes peptidases) ne peuvent être utilisées pour déterminer la séquence d’acides aminés de protéines ou de peptides de grande taille. Pour
ces macromolécules, il est préférable d’effectuer plutôt une hydrolyse partielle a?n de
briser la chaîne peptidique en plus petits fragments ; ces derniers pourront être isolés
et analysés plus facilement par la suite. Après avoir déterminé la séquence des résidus
d’acides aminés pour chacun des fragments isolés, il devient alors possible, par chevauchement, de reconstituer la séquence complète du polypeptide de départ.
Deux enzymes et un réactif chimique sont souvent utilisés pour hydrolyser
certaines liaisons peptidiques de façon spéci?que. Ces agents de clivage sont les
enzymes trypsine et chymotrypsine, ainsi que le cyanure de brome, aussi appelé
« bromure de cyanogène ». Le tableau 6.4 décrit la spéci?cité de clivage pour chacun
de ces agents.
Tableau 6.4 Enzymes ou réactifs utilisés pour le clivage sélectif
des polypeptides
Agent utilisé
Site de clivage
trypsine
Extrémité carboxylée (à droite) de Arg (R) et Lys (K)
chymotrypsine
Extrémité carboxylée (à droite) de Phe (F), Trp (W) et Tyr (Y)
cyanure de brome (BrCN)
Extrémité carboxylée (à droite) de Met (M)
6.7 Propriétés physiques des peptides et des protéines
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