33
pesant 25 g de farine, auxquels on ajoute 225 ml de bouillon au Sélénite et des disques SFB,
suivi d'une incubation à 37°C pendant 24 heures. Les flacons positifs présentent un virage
jaune-orange. Ensuite, 1 ml du bouillon est transféré dans un nouveau tube contenant du SFB
pour une seconde incubation. L'isolement se fait en repiquant sur gélose S-S, avec incubation à
37°C. Les colonies suspectes sont incolores, avec ou sans centre noir. Les colonies sont
réisolées pour purification.
Une série de tests biochimiques confirme la présence des Salmonelles, incluant la coloration de
Gram, la catalase (positive), l'oxydase (négative), la mobilité sur gélose Mannitol, le test TSI,
ainsi que des tests supplémentaires comme l'uréase, l'indole, et la galerie API20E pour une
identification précise.
III.3 Extraction de l’huile brute de concombre de mer
L’huile brute de concombre de mer est extraite à partir du liquide obtenu lors du traitement des
échantillons. Ce liquide est recueilli après la cuisson des tissus de concombre de mer, puis
transvasé dans des ampoules à décanter. Après décantation, la phase supérieure contenant
l’huile est récupérée et soumise à une centrifugation à 1500 tr/min pendant 15 minutes,
permettant ainsi d’obtenir l’huile brute.
III.4 Gélatine et collagène
III.4.1 Procédure d’extraction de collagène
Le collagène est extrait en suivant une méthode adaptée de (Nagai et Suzuki.,2000). D'abord,
les morceaux de peau sont pesés, découpés, puis agités dans de l'eau distillée pendant 5 minutes.
Ils sont ensuite immergés dans une solution de NaOH (0,2 M) à un ratio de 1 :10 (poids/volume)
et laissés à 4°C pendant 24 heures pour la déprotéinisation. Après ce processus, les échantillons
sont filtrés et rincés à l'eau distillée jusqu'à neutralisation du pH. Pour la déminéralisation, les
échantillons sont placés dans une solution d'EDTA (0,2 M) au même ratio et conservés au
réfrigérateur pendant 48 heures, suivis d'un rinçage à l'eau distillée. Le collagène est ensuite
pré-extrait dans une solution d'acide acétique (0,5 M) pendant 4 jours à 4°C, puis la solution est
centrifugée à 14 000 tr/min pendant 30 minutes. Le surnageant est récupéré et le collagène est
précipité en ajoutant successivement une solution de NaCl (2,4 M) et d'acide acétique (0,5 M).
Enfin, la solution est dialysée contre de l'eau distillée pendant 48 heures, avant d'être lyophilisée
et broyée pour obtenir une poudre de collagène.
III.4.2 Procédure d’extraction de la gélatine
L'extraction de la gélatine à partir des coproduits de l’holothurie suit un protocole rigoureux.
Tout d'abord, les coproduit sont soigneusement lavées, découpées en petits morceaux, puis
pesées. Ces fragments sont ensuite placés dans une solution de NaCl à 0,75 M dans une
pesant 25 g de farine, auxquels on ajoute 225 ml de bouillon au Sélénite et des disques SFB,
suivi d'une incubation à 37°C pendant 24 heures. Les flacons positifs présentent un virage
jaune-orange. Ensuite, 1 ml du bouillon est transféré dans un nouveau tube contenant du SFB
pour une seconde incubation. L'isolement se fait en repiquant sur gélose S-S, avec incubation à
37°C. Les colonies suspectes sont incolores, avec ou sans centre noir. Les colonies sont
réisolées pour purification.
Une série de tests biochimiques confirme la présence des Salmonelles, incluant la coloration de
Gram, la catalase (positive), l'oxydase (négative), la mobilité sur gélose Mannitol, le test TSI,
ainsi que des tests supplémentaires comme l'uréase, l'indole, et la galerie API20E pour une
identification précise.
III.3 Extraction de l’huile brute de concombre de mer
L’huile brute de concombre de mer est extraite à partir du liquide obtenu lors du traitement des
échantillons. Ce liquide est recueilli après la cuisson des tissus de concombre de mer, puis
transvasé dans des ampoules à décanter. Après décantation, la phase supérieure contenant
l’huile est récupérée et soumise à une centrifugation à 1500 tr/min pendant 15 minutes,
permettant ainsi d’obtenir l’huile brute.
III.4 Gélatine et collagène
III.4.1 Procédure d’extraction de collagène
Le collagène est extrait en suivant une méthode adaptée de (Nagai et Suzuki.,2000). D'abord,
les morceaux de peau sont pesés, découpés, puis agités dans de l'eau distillée pendant 5 minutes.
Ils sont ensuite immergés dans une solution de NaOH (0,2 M) à un ratio de 1 :10 (poids/volume)
et laissés à 4°C pendant 24 heures pour la déprotéinisation. Après ce processus, les échantillons
sont filtrés et rincés à l'eau distillée jusqu'à neutralisation du pH. Pour la déminéralisation, les
échantillons sont placés dans une solution d'EDTA (0,2 M) au même ratio et conservés au
réfrigérateur pendant 48 heures, suivis d'un rinçage à l'eau distillée. Le collagène est ensuite
pré-extrait dans une solution d'acide acétique (0,5 M) pendant 4 jours à 4°C, puis la solution est
centrifugée à 14 000 tr/min pendant 30 minutes. Le surnageant est récupéré et le collagène est
précipité en ajoutant successivement une solution de NaCl (2,4 M) et d'acide acétique (0,5 M).
Enfin, la solution est dialysée contre de l'eau distillée pendant 48 heures, avant d'être lyophilisée
et broyée pour obtenir une poudre de collagène.
III.4.2 Procédure d’extraction de la gélatine
L'extraction de la gélatine à partir des coproduits de l’holothurie suit un protocole rigoureux.
Tout d'abord, les coproduit sont soigneusement lavées, découpées en petits morceaux, puis
pesées. Ces fragments sont ensuite placés dans une solution de NaCl à 0,75 M dans une