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- Un gramme (1g) de l’échantillon a été mélangé à 9 ml d’eau distillée stérile, puis la solution
a été homogénéisée avec un vortex pendant 10 minutes jusqu'à obtention d'une solution
homogène.
2. Préparation des dilutions décimales
Pour les milieux avec une forte concentration de microorganismes, des dilutions décimales sont
réalisées pour faciliter le dénombrement. Le diluant utilisé est de l'eau distillée stérile, selon
Bonnefoy et al. (2002) . La suspension mère, préparée précédemment, est considérée comme la
dilution 10⁻¹. Pour obtenir les dilutions 10⁻² et 10⁻³, 9 ml de diluant sont ajoutés dans des tubes
à essais. 1 ml de la suspension mère est transféré aseptiquement dans le tube de dilution 10⁻²,
en évitant tout contact entre la pipette et le diluant. Ensuite, 1 ml de la dilution 10⁻² est transféré
dans un tube contenant 9 ml de diluant pour préparer la dilution 10⁻³. Pour garantir un volume
uniforme, 1 ml de la dernière dilution est éliminé.
A. Détection et dénombrement des coliformes totaux et fécaux
Les coliformes, des bacilles Gram négatif, non sporogènes, oxydase négative, aéro-anaérobies
facultatifs, fermentent le lactose produisant acide et gaz en 24 à 48 heures à 37°C. Leur
détection et dénombrement se font par une méthode en milieu liquide, comprenant deux tests
successifs : un test présomptif avec un milieu BCPL pour identifier les coliformes totaux et un
test confirmatif avec un bouillon BLBVB pour spécifier les coliformes fécaux.
La méthode du Nombre le Plus Probable (NPP) nécessite la préparation d’une série de 9 tubes
pour chaque échantillon, chacun contenant le milieu de culture et une cloche de Durham.
Test de présomption :
Le test de présomption pour détecter les coliformes se déroule en plusieurs étapes : introduire
1 ml de la suspension mère à différentes dilutions (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³) dans trois tubes par série.
Après avoir expulsé le gaz des cloches de Durham et bien mélangé le milieu et l’inoculum,
incubé les tubes à 37°C pendant 24 à 48 heures. Un tube est considéré comme positif s'il montre
un trouble microbien, un changement de couleur vers le jaune, et la présence de gaz dans la
cloche de Durham, avec un volume de gaz supérieur à 1/10 du volume de la cloche.
Test de confirmation :
Le test de confirmation suit un procédé similaire au test de présomption, mais les tubes sont
incubés à 44°C pendant 24 heures. Un tube est considéré comme positif s'il montre un trouble
microbien et la présence de gaz dans la cloche de Durham, avec un volume de gaz supérieur à
1/10 du volume de la cloche.
- Un gramme (1g) de l’échantillon a été mélangé à 9 ml d’eau distillée stérile, puis la solution
a été homogénéisée avec un vortex pendant 10 minutes jusqu'à obtention d'une solution
homogène.
2. Préparation des dilutions décimales
Pour les milieux avec une forte concentration de microorganismes, des dilutions décimales sont
réalisées pour faciliter le dénombrement. Le diluant utilisé est de l'eau distillée stérile, selon
Bonnefoy et al. (2002) . La suspension mère, préparée précédemment, est considérée comme la
dilution 10⁻¹. Pour obtenir les dilutions 10⁻² et 10⁻³, 9 ml de diluant sont ajoutés dans des tubes
à essais. 1 ml de la suspension mère est transféré aseptiquement dans le tube de dilution 10⁻²,
en évitant tout contact entre la pipette et le diluant. Ensuite, 1 ml de la dilution 10⁻² est transféré
dans un tube contenant 9 ml de diluant pour préparer la dilution 10⁻³. Pour garantir un volume
uniforme, 1 ml de la dernière dilution est éliminé.
A. Détection et dénombrement des coliformes totaux et fécaux
Les coliformes, des bacilles Gram négatif, non sporogènes, oxydase négative, aéro-anaérobies
facultatifs, fermentent le lactose produisant acide et gaz en 24 à 48 heures à 37°C. Leur
détection et dénombrement se font par une méthode en milieu liquide, comprenant deux tests
successifs : un test présomptif avec un milieu BCPL pour identifier les coliformes totaux et un
test confirmatif avec un bouillon BLBVB pour spécifier les coliformes fécaux.
La méthode du Nombre le Plus Probable (NPP) nécessite la préparation d’une série de 9 tubes
pour chaque échantillon, chacun contenant le milieu de culture et une cloche de Durham.
Test de présomption :
Le test de présomption pour détecter les coliformes se déroule en plusieurs étapes : introduire
1 ml de la suspension mère à différentes dilutions (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³) dans trois tubes par série.
Après avoir expulsé le gaz des cloches de Durham et bien mélangé le milieu et l’inoculum,
incubé les tubes à 37°C pendant 24 à 48 heures. Un tube est considéré comme positif s'il montre
un trouble microbien, un changement de couleur vers le jaune, et la présence de gaz dans la
cloche de Durham, avec un volume de gaz supérieur à 1/10 du volume de la cloche.
Test de confirmation :
Le test de confirmation suit un procédé similaire au test de présomption, mais les tubes sont
incubés à 44°C pendant 24 heures. Un tube est considéré comme positif s'il montre un trouble
microbien et la présence de gaz dans la cloche de Durham, avec un volume de gaz supérieur à
1/10 du volume de la cloche.