Matériel et méthodes
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Figure 44 : Recherche de la Gélatinase
II-9 Mise en évidence de la production de Bactériocines par antagonisme
Méthode de diffusion par puits (Barefoot et Klaenhamnmer, 1983). Cette méthode a été
modifiée par plusieurs auteurs comme Puizani et al, (1992). Cette méthode consiste à :
1/ Les souches productrices de substances inhibitrices sont cultivées dans du milieu MRS
liquide et incubées à 37°C pendant 16 à 24h en anaérobiose, ce qui évite la formation du
peroxyde d’hydrogène (H2O2).
2/ Après incubation, le milieu est centrifugé (4000 tr/min, 15 min) et le surnageant est alors
séparé du culot, filtré et neutralisé avec du NaOH (1N) afin d’avoir un pH entre 6,8-7 et il est
conservé à 4°C.
3/ Dans une boite de Pétri contenant du Müller Hinton solide et ensemencé initialement par la
souche pathogène : E. coli, (correspondant à 106 UFT/ml à 625nm) par écouvillonnage. On
laisse les boites sécher à température ambiante pendant 30minutes, des puits sont ensuite
réalisés avec un emporte-pièce ou une cloche de Durham stérile.
4/ Ces puits recevront 100μl du surnageant brut de la culture lactique à tester et les boites seront
mises à 4°C pendant 2heures pour permettre une bonne diffusion du surnageant.
5/ Les boites sont ensuite incubées pendant 24 h à 37°C.
6/ Les puits entourés d'une zone claire d'inhibition de la souche test et ayant un diamètre
supérieur à 2 mm sont considérées comme positive. (Barefoot, S. F., & Klaenhammer, T. R.
(1983).