CHAPITRE II
Matériel & Méthodes
II.5.1 Identification et caractérisation des bactéries résistantes
Pour identifier les différentes bactéries résistantes aux métaux lourds, nous avons appliqué une série de tests énumérés ci-dessous.
II.5.1.1 La coloration de GRAM
La coloration de Gram permet de déterminer deux grands groupes bactériens (Gram positif et Gram
négatif), elle nous permet aussi de reconnaitre la morphologie et le mode de regroupement des bactéries (Joffin et Leyral 2006).
Les étapes de la méthode sont comme suit :
— Préparation d’un frottis sec :
Mettre une goutte d’eau distillée stérile sur la lame, prélever Stérilement, à l’aide d’une anse
de platine, une parcelle d’une colonie bactérienne jeune de (18-24h), émulsionner cette colonie sur la goutte d’eau sur la lame, le frottis doit être étaler en couche mince et régulière
pour bien séparer les cellules bactériennes. Sécher la lame et fixer la par un passage 3 à 4
fois dans la flamme du bec bensun.
— Coloration au Violet de Gentiane :
Chaque frottis fixé est coloré pendant 1 min au Violet de Gentiane puis laver à l’eau courante.
— Mordançage :
Traiter durant une minute la lame par une solution de Lugol, puis rincer à l’eau courante. Le
lugol forme avec le Violet de Gentiane un complexe ce qui renforce la coloration.
— Décoloration :
Inonder la lame d’alcool pendant 15 secondes puis rincer immédiatement à l’eau courante.
À ce stade les cellules à Gram négatif seront incolores, les cellules à Gram positif restent
violettes.
— Contre coloration avec de la Fuchsine :
Rajouter de la Fuchsine sur les lames pendant 1 min, puis rincer à l’eau courante. Sécher la
lame au dessus de la flamme d’un bec Bunsen, ou la sécher délicatement entre deux feuilles
de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
— Lecture :
Examiner les lames colorées au microscope optique en ajoutant une goutte d’huile à immersion (au Gx100). En raison de leur paroi de structure plus épaisse et de composition chimique
particulière, les bactéries Gram+ gardent la coloration violette Fig.II.4. Les bactéries GramFig.II.4, avec une paroi plus fine et plus perméable à la décoloration, perdent la couleur violette. De manière à visualiser les bactéries Gram-, on recolore avec de la fuchsine (rose)
Fig.II.5.
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Matériel & Méthodes
II.5.1 Identification et caractérisation des bactéries résistantes
Pour identifier les différentes bactéries résistantes aux métaux lourds, nous avons appliqué une série de tests énumérés ci-dessous.
II.5.1.1 La coloration de GRAM
La coloration de Gram permet de déterminer deux grands groupes bactériens (Gram positif et Gram
négatif), elle nous permet aussi de reconnaitre la morphologie et le mode de regroupement des bactéries (Joffin et Leyral 2006).
Les étapes de la méthode sont comme suit :
— Préparation d’un frottis sec :
Mettre une goutte d’eau distillée stérile sur la lame, prélever Stérilement, à l’aide d’une anse
de platine, une parcelle d’une colonie bactérienne jeune de (18-24h), émulsionner cette colonie sur la goutte d’eau sur la lame, le frottis doit être étaler en couche mince et régulière
pour bien séparer les cellules bactériennes. Sécher la lame et fixer la par un passage 3 à 4
fois dans la flamme du bec bensun.
— Coloration au Violet de Gentiane :
Chaque frottis fixé est coloré pendant 1 min au Violet de Gentiane puis laver à l’eau courante.
— Mordançage :
Traiter durant une minute la lame par une solution de Lugol, puis rincer à l’eau courante. Le
lugol forme avec le Violet de Gentiane un complexe ce qui renforce la coloration.
— Décoloration :
Inonder la lame d’alcool pendant 15 secondes puis rincer immédiatement à l’eau courante.
À ce stade les cellules à Gram négatif seront incolores, les cellules à Gram positif restent
violettes.
— Contre coloration avec de la Fuchsine :
Rajouter de la Fuchsine sur les lames pendant 1 min, puis rincer à l’eau courante. Sécher la
lame au dessus de la flamme d’un bec Bunsen, ou la sécher délicatement entre deux feuilles
de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
— Lecture :
Examiner les lames colorées au microscope optique en ajoutant une goutte d’huile à immersion (au Gx100). En raison de leur paroi de structure plus épaisse et de composition chimique
particulière, les bactéries Gram+ gardent la coloration violette Fig.II.4. Les bactéries GramFig.II.4, avec une paroi plus fine et plus perméable à la décoloration, perdent la couleur violette. De manière à visualiser les bactéries Gram-, on recolore avec de la fuchsine (rose)
Fig.II.5.
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