MATERIELS ET METHODES
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Dans le cas d’apparition de colonies caractéristiques après incubation, quelques colonies
seront repiquées en triple stries sur GN, puis les cultures pures obtenues devront être utilisées
pour une coloration de Gram, un test Catalase et un Test Oxydase.
Lecture
Les colonies caractéristiques ayant une forme cellulaire Cocci en grappe de raisin, de
couleur violette (Gram positif), Oxydase négative et Catalase positive, pourront être
potentiellement considérées comme des S. aureus, en attendant la confirmation par la galerie
Api Staph.
La coloration de Gram
La coloration de Gram est la coloration différentielle, qui permet de différencier les
bactéries selon leur forme et leur affinité pour les colorants. Cette technique permet de classer
les bactéries en 2 groupes, Gram positif ou Gram négatif. Elle permet aussi de distinguer entre
les différentes formes et agencements des cellules bactériennes (coccobacille, bacille, cocci, en
amas, en chainette, …).
Pour préparer et colorer un frottis bactérien, une colonie isolée a est étalée en couche mince
sur une lame propre avec une goutte d'eau distillée, puis séchée à l’air libre, jusqu’à obtenir un
aspect mat. Après séchage, la fixation du frottis est effectuée par le passage de la lame dans la
flamme avant de la laisser refroidir. Ensuite, la coloration différentielle est réalisée en inondant
le frottis fixé avec du cristal violet pendant 1 min, suivi du mordant (iode ou Lugol) qui est
appliqué pendant 1 min. Après chaque étape, la lame doit être rincée à l'eau pendant 2 secondes.
L'agent décolorant est appliqué pendant 15 sec, puis le contre-colorant (safranine) est appliqué
de 30 sec à 1 min et rincé juste après. Enfin, le frottis est observé au microscope avec huile à
immersion, où les bactéries à Gram négatif apparaîtront en rose/rouge et celles à Gram positif
en bleu/violet.
Test de la catalase
La catalase est une enzyme qui dégrade le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène
moléculaire (Harvey et al., 2007). Les organismes catalase-positive, en contact direct avec le
peroxyde d’hydrogène, produisent rapidement des bulles d’air.
Pour ce test, une petite quantité a été prélevée, à partir d’une culture pure cultivée sur GN
ou PCA, et a ensuite été étalée sur une lame propre, puis quelques gouttes de peroxyde
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Dans le cas d’apparition de colonies caractéristiques après incubation, quelques colonies
seront repiquées en triple stries sur GN, puis les cultures pures obtenues devront être utilisées
pour une coloration de Gram, un test Catalase et un Test Oxydase.
Lecture
Les colonies caractéristiques ayant une forme cellulaire Cocci en grappe de raisin, de
couleur violette (Gram positif), Oxydase négative et Catalase positive, pourront être
potentiellement considérées comme des S. aureus, en attendant la confirmation par la galerie
Api Staph.
La coloration de Gram
La coloration de Gram est la coloration différentielle, qui permet de différencier les
bactéries selon leur forme et leur affinité pour les colorants. Cette technique permet de classer
les bactéries en 2 groupes, Gram positif ou Gram négatif. Elle permet aussi de distinguer entre
les différentes formes et agencements des cellules bactériennes (coccobacille, bacille, cocci, en
amas, en chainette, …).
Pour préparer et colorer un frottis bactérien, une colonie isolée a est étalée en couche mince
sur une lame propre avec une goutte d'eau distillée, puis séchée à l’air libre, jusqu’à obtenir un
aspect mat. Après séchage, la fixation du frottis est effectuée par le passage de la lame dans la
flamme avant de la laisser refroidir. Ensuite, la coloration différentielle est réalisée en inondant
le frottis fixé avec du cristal violet pendant 1 min, suivi du mordant (iode ou Lugol) qui est
appliqué pendant 1 min. Après chaque étape, la lame doit être rincée à l'eau pendant 2 secondes.
L'agent décolorant est appliqué pendant 15 sec, puis le contre-colorant (safranine) est appliqué
de 30 sec à 1 min et rincé juste après. Enfin, le frottis est observé au microscope avec huile à
immersion, où les bactéries à Gram négatif apparaîtront en rose/rouge et celles à Gram positif
en bleu/violet.
Test de la catalase
La catalase est une enzyme qui dégrade le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène
moléculaire (Harvey et al., 2007). Les organismes catalase-positive, en contact direct avec le
peroxyde d’hydrogène, produisent rapidement des bulles d’air.
Pour ce test, une petite quantité a été prélevée, à partir d’une culture pure cultivée sur GN
ou PCA, et a ensuite été étalée sur une lame propre, puis quelques gouttes de peroxyde