CHAPITRE III
58
préparé en ajoutant le volume d’échantillon après le TCA. Les tubes sont incubés pendant 30
minutes à 37°C, puis centrifugés à 9000 tr/mn pendant 5 min. Ensuite, 1 ml de surnageant est
mélangé avec 2.5 ml de Na2CO3 et 0.5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu dilué 4 fois. Les tubes
sont vortexés puis maintenus à l’obscurité pendant 30 minutes avant d’être centrifugés à 9000
tr/mn pendant 5 min pour permettre la lecture de l’absorbance du surnageant à 660 nm.
L’expression des résultats :
L’activité enzymatique est exprimée en unité internationale par mg de protéines. Une unité (U)
de l’activité des protéases corresponde à la quantité d’enzyme nécessaire pour libérer 1 µg de
tyrosine par minute (Saha et al., 2006). L’activité des protéases est déterminée selon la formule
suivante (Cupp-Enyard, 2008) :
U / ml de protéases = µg tyrosine × FD × Vt / t × V1…………….(17)
µg tyrosine : déterminé à partir de la courbe d’étalonnage
FD : facteur de dilution
Vt : volume du mélange réactionnel (6 ml)
V1 : volume de l’échantillon (1ml)
t : temps de réaction en minute
1.8.2. Alpha-amylase
Principe : L’activité de l’alpha-amylase dans le tube digestif et le foie des juvéniles du tilapia
est déterminée selon la méthode de Bernfeld (1955) en utilisant l’amidon come substrat. Le
principe est basé sur la réduction de l'acide 3,5-dinitrosalycilique (DNS) par les sucres
réducteurs (maltose) libérés de l’amidon, pour donner un composé de coloration rouge
susceptible d’un dosage spectrophotométrique.
Réactifs :
- Tampon phosphate (pH 6.9) : préparation d’une solution contenant 2.4 mg/ml de phosphate
de sodium monobasique et 0.39 mg/ml de chlorure de sodium. Le pH est ajusté à 6.9 avec
le NaOH.
- Solution d’amidon à 1% : dissolution de 1 g d’amidon dans 100 ml du tampon phosphate,
avec agitation et chauffage jusqu’à ébullition pendant 15 min.
- Hydroxyde de sodium (NaOH) à 80 mg/ml
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préparé en ajoutant le volume d’échantillon après le TCA. Les tubes sont incubés pendant 30
minutes à 37°C, puis centrifugés à 9000 tr/mn pendant 5 min. Ensuite, 1 ml de surnageant est
mélangé avec 2.5 ml de Na2CO3 et 0.5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu dilué 4 fois. Les tubes
sont vortexés puis maintenus à l’obscurité pendant 30 minutes avant d’être centrifugés à 9000
tr/mn pendant 5 min pour permettre la lecture de l’absorbance du surnageant à 660 nm.
L’expression des résultats :
L’activité enzymatique est exprimée en unité internationale par mg de protéines. Une unité (U)
de l’activité des protéases corresponde à la quantité d’enzyme nécessaire pour libérer 1 µg de
tyrosine par minute (Saha et al., 2006). L’activité des protéases est déterminée selon la formule
suivante (Cupp-Enyard, 2008) :
U / ml de protéases = µg tyrosine × FD × Vt / t × V1…………….(17)
µg tyrosine : déterminé à partir de la courbe d’étalonnage
FD : facteur de dilution
Vt : volume du mélange réactionnel (6 ml)
V1 : volume de l’échantillon (1ml)
t : temps de réaction en minute
1.8.2. Alpha-amylase
Principe : L’activité de l’alpha-amylase dans le tube digestif et le foie des juvéniles du tilapia
est déterminée selon la méthode de Bernfeld (1955) en utilisant l’amidon come substrat. Le
principe est basé sur la réduction de l'acide 3,5-dinitrosalycilique (DNS) par les sucres
réducteurs (maltose) libérés de l’amidon, pour donner un composé de coloration rouge
susceptible d’un dosage spectrophotométrique.
Réactifs :
- Tampon phosphate (pH 6.9) : préparation d’une solution contenant 2.4 mg/ml de phosphate
de sodium monobasique et 0.39 mg/ml de chlorure de sodium. Le pH est ajusté à 6.9 avec
le NaOH.
- Solution d’amidon à 1% : dissolution de 1 g d’amidon dans 100 ml du tampon phosphate,
avec agitation et chauffage jusqu’à ébullition pendant 15 min.
- Hydroxyde de sodium (NaOH) à 80 mg/ml