Chapitre II
Matériel et méthodes
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3. Verser du Lugol pour fixer le violet de gentiane et le laisser agir pendant 1 minute ;
rincer à l’eau distillée.
4. Décolorer à l'alcool à 95°, entre 15 et 30 secondes puis rincer avec de l’eau distillée.
5. Recolorer avec de la fuchsine pendant 10 à 30 secondes : rincer à l'eau distillée.
6. Sécher au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen.
L’observation microscopique est réalisée sous microscope à l’objectif à immersion (100 x
avec ajout de l’huile de paraffine). Avec cette coloration double, les bactéries « Gram + »
apparaissent en violet foncé avec la forme Cocci tandis que les bactéries « Gram - » sont
colorées en rose ou en rouge avec une forme bacille (fig. 12).
II.3.3.2. Test oxydase
L’oxydase est une enzyme qui catalyse une réaction d'oxydoréduction impliquant une
molécule de dioxygène (O2) comme accepteur d'électrons. La mise en évidence de l’oxydase
a été faite selon la méthode des disques d’oxydase qui consiste à déposer sur une lame un
disque d’oxydase, et prélever une colonie à l’aide d’une pipette Pasteur et l’étaler sur le
disque.
La présence d'une cytochrome-oxydase se traduit, en 20 à 60 secondes, par l'apparition d'une
coloration rouge virant rapidement au violet très foncé (Denis et al., 2007). Si la colonie reste
incolore, le germe ne possède pas d’oxydase, le test est négatif (fig. 13).
Figure 12 : Coloration de gram sous microscope