9 Structural Biology in Situ Using Cryo-Electron Subtomogram
Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
Stefan Pfeffer and Friedrich Förster
9.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
9.2 Increasing the Resolution of Volumetric Data by Averaging . . . 238
9.3 Particle Localization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
9.3.1 Template-Free Approaches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
9.3.2 Template Matching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
9.3.3 Peak Selection After Template Matching. . . . . . . . . . . . 240
9.3.4 Example Dataset . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
9.4 Subtomogram Alignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
9.4.1 Scoring Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
9.4.2 Sampling Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
9.4.3 Example Dataset . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
9.5 Subtomogram Classification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
9.5.1 Uncoupled Alignment and Classification . . . . . . . . . . . . 246
9.5.2 Simultaneous Alignment and Classification . . . . . . . . . . 246
9.5.3 Example Dataset . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
9.6 Available Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
9.7 Selected Recent Applications of Subtomogram Averaging . . . . . 248
9.7.1 Ribosomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
9.7.2 Other Cytosolic Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
9.7.3 Membrane Protein Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
9.8 Practical Section: Step-by-Step Guide for Subtomogram
Analysis Using av3 and PyTom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
9.8.1 Template Matching and Peak Selection . . . . . . . . . . . . . 251
9.8.2 Extraction and Alignment of Subtomograms . . . . . . . . . 253
9.8.3 Classification of Subtomograms Using CPCA
and Kmeans Clustering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
10 Resolution in Electron Tomography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
Mikhail Kudryashev
10.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
10.2 Limits Imposed by Sample Preparation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
10.2.1 Sectioning- and SEM-Based Methods . . . . . . . . . . . . . . 263
10.2.2 Imaging Cryo Preserved Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
10.3 Resolution of Tomographic Reconstructions. . . . . . . . . . . . . . . . 266
10.3.1 Geometric Limits. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
10.3.2 TEM Electron Optical Limits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
10.3.3 STEM Tomography. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272
10.3.4 Measuring the Resolution of Tomograms . . . . . . . . . . . 272
10.4 Limits of Subtomogram Averaging. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
10.4.1 Alignment of Subtomograms to the Average. . . . . . . . . 275
xiv
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