Les sélectines
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gosaccharide). Ces néoglycolipides se séparent par une technique familière aux
chimistes organiciens, la chromatographie sur couche mince de gel de silice, avec
un irrigant assez polaire, CHCI, - MeOH - H,O, 60:35 :8, v/v/v. Après la migration, on << révèle >> la plaque en la recouvrant avec une suspension de cellules
CHO-E qui expriment la sélectine E. S’il y a dans le mélange un oligosaccharide
ligand de la sélectine E, les cellules viennent adhérer à la tache correspondante.
On élimine l’excès de cellule par lavage et on repère le site d’adhésion en mettant
en évidence les cellules fixées. Diverses méthodes de visualisation sont possibles.
L‘une d’entre elles utilise des cellules marquées au départ par du tritium et repère donc finalement la position du ligand par autoradiographie. On peut analyser
directement les taches par spectrométrie de masse. On voit l’économie de temps
réalisé avec cette méthode, puisqu’on n’analyse que les structures déjà repérées
comme actives.
L‘observation de départ est que les cellules CHO-E sont fortement retenues sur
une glycoprotéine riche en carbohydrates d’origine ovarienne. I1 y a donc sur cette
glycoprotéine des séquences oligosaccharidiques qui se combinent à la sélectine
E. On isole les oligosaccharides par hydrolyse acide et on les convertit en négolycolipides. La technique de recouvrement décrite ci-dessus permet alors de
mettre en évidence une fraction particulièrement active dans le mélange.
L‘analyse par spectrométrie de masse et methylation indique qu’il s’agit d’un
mélange équimoléculaire des néoglycolipides présentant les tétrasaccharides sulfatés 17.27 et 17.28 à l’extrémité terminale non réductrice. Une étude antérieure
avait montré que les séquences des oligosaccharides sialylés 17.29 << 3’-sialylLea B et 17.30 << 3’-sialyl-LeX D étaient également reconnues par la sélectine E,
mais l’affinité de 17.27 et de 17.28 est supérieure.
En tout cas, cela souligne l’importance de l’anion dans cette reconnaissance
particulière, car le détachement du résidu sialique dans 17.29 et dans 17.30 par
l’enzyme neuraminidase abolit la réaction. La modélisation de la structure des
tétrasaccharides 17.27 et 17.29 indique que leurs groupements anioniques (-SO;
HSO, - 3 Gal (1 - 3) GlcNAc 1 - 3 Gal
I :
Fuc
17.27
HSO, - 3 Gal (I - 4) GlcNAc 1 - 3 Gal
I:
FUC
17.28
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gosaccharide). Ces néoglycolipides se séparent par une technique familière aux
chimistes organiciens, la chromatographie sur couche mince de gel de silice, avec
un irrigant assez polaire, CHCI, - MeOH - H,O, 60:35 :8, v/v/v. Après la migration, on << révèle >> la plaque en la recouvrant avec une suspension de cellules
CHO-E qui expriment la sélectine E. S’il y a dans le mélange un oligosaccharide
ligand de la sélectine E, les cellules viennent adhérer à la tache correspondante.
On élimine l’excès de cellule par lavage et on repère le site d’adhésion en mettant
en évidence les cellules fixées. Diverses méthodes de visualisation sont possibles.
L‘une d’entre elles utilise des cellules marquées au départ par du tritium et repère donc finalement la position du ligand par autoradiographie. On peut analyser
directement les taches par spectrométrie de masse. On voit l’économie de temps
réalisé avec cette méthode, puisqu’on n’analyse que les structures déjà repérées
comme actives.
L‘observation de départ est que les cellules CHO-E sont fortement retenues sur
une glycoprotéine riche en carbohydrates d’origine ovarienne. I1 y a donc sur cette
glycoprotéine des séquences oligosaccharidiques qui se combinent à la sélectine
E. On isole les oligosaccharides par hydrolyse acide et on les convertit en négolycolipides. La technique de recouvrement décrite ci-dessus permet alors de
mettre en évidence une fraction particulièrement active dans le mélange.
L‘analyse par spectrométrie de masse et methylation indique qu’il s’agit d’un
mélange équimoléculaire des néoglycolipides présentant les tétrasaccharides sulfatés 17.27 et 17.28 à l’extrémité terminale non réductrice. Une étude antérieure
avait montré que les séquences des oligosaccharides sialylés 17.29 << 3’-sialylLea B et 17.30 << 3’-sialyl-LeX D étaient également reconnues par la sélectine E,
mais l’affinité de 17.27 et de 17.28 est supérieure.
En tout cas, cela souligne l’importance de l’anion dans cette reconnaissance
particulière, car le détachement du résidu sialique dans 17.29 et dans 17.30 par
l’enzyme neuraminidase abolit la réaction. La modélisation de la structure des
tétrasaccharides 17.27 et 17.29 indique que leurs groupements anioniques (-SO;
HSO, - 3 Gal (1 - 3) GlcNAc 1 - 3 Gal
I :
Fuc
17.27
HSO, - 3 Gal (I - 4) GlcNAc 1 - 3 Gal
I:
FUC
17.28