Détermination des séquences par les méthodes spectroscopiques
149
Ceci était nécessaire, car on a rarement les oligosaccharides vraiment importants
en quantité notable. Ils proviennent souvent de sources humaines. Les méthodes
spectroscopiques, que nous abordons maintenant, permettent de reculer un peu
plus loin les limites d’investigation.
9.4 DÉTERMINATION DES SÉQUENCES PAR LES MÉTHODES
SPECTROSCOPIQUES
9.4.1 Spectrométrie de masse f.a.b
Dans cette spectroscopie[6], dont le nom est l’abrégé de <(fast atom bombardment », un jet d’atomes ou d’ions accélérés est projeté sur une cible constituée par
une solution de l’échantillon dans un liquide visqueux. En frappant la surface de
la cible, les atomes transmettent leur énergie cinétique aux molécules de l’échantillon. Beaucoup sont projetées hors de la cible dans le vide de la source d’ions et
ionisées en proportion notable. De cette façon, les ions en phase gazeuse sont produits sans volatilisation préalable de l’échantillon. TI se forme des ions positifs
[M + HI+, [M + cation]’ et négatifs [M - HI-, surtout, et aussi, [M + anion]-, selon
la nature de l’échantillon et de la matrice visqueuse. On emploie de préférence le
glycérol avec les molécules polaires, tels que les oligosaccharides et les glycopeptides natifs, mais pour les composés hydrophobes comme les glycosphingolipides, qui ont tendance à s’agglomérer dans les solvants polaires, on préfère le
1-thioglycérol CH,SH - CHOH - CH,OH. I1 est utile d’acidifier le mélange avec
des traces d’HCI dilué. L‘addition d’acétate de sodium entraîne la formation
d’ions [M + Na]+. L‘addition de thiocyanate d’ammonium à certains oligosaccharides perméthylés entraîne la formation d’ions [M + NHJ et [M + SCNI-.
Seules les molécules présentes à la surface de la matrice sont ionisées par le jet
atomique et il faut éviter la présence d’impuretés plus tensio-actives qui les en
chasseraient.
On observe des pics intenses d’ions pseudo-monomoléculaires et des pics de
fragments. On emploie les sucres non dérivés pour déterminer M, mais il est souvent utile de préparer d’abord un dérivé par perméthylation (voir le paragraphe
9.3.3) ou peracétylation (traitement par un mélange d’acide acétique et d’anhydride trifluoracétique, 2 :1, v/v, 9 mn à température ambiante). Les quantités
d’échantillon nécessaires à l’investigation sont 1-9 pg de sucre libre, ou O, 1-5pg
de dérivé. Trois types de sucre donnent des pics au-dessus de M 4000 : les polysaccharides perméthylés, les glycosphingolipides perméthylés et les formes naturelles acylées des polysaccharides mycobactériens.
Nous donnerons deux modes de clivage, désignés comme dans la référenceL6]
(Fig. 9.5). Dans le mode A, le principal, la charge est retenue sur le fragment du
côté de l’extrémité non réductrice. Dans le mode B, la charge est retenue du côté
de l’extrémité réductrice. Avec les oligosaccharides dérivés, MNPQR, où M est le
résidu monosaccharidique du côté non réducteur, on observe principalement la
voie A selon l’équation (9.2).
149
Ceci était nécessaire, car on a rarement les oligosaccharides vraiment importants
en quantité notable. Ils proviennent souvent de sources humaines. Les méthodes
spectroscopiques, que nous abordons maintenant, permettent de reculer un peu
plus loin les limites d’investigation.
9.4 DÉTERMINATION DES SÉQUENCES PAR LES MÉTHODES
SPECTROSCOPIQUES
9.4.1 Spectrométrie de masse f.a.b
Dans cette spectroscopie[6], dont le nom est l’abrégé de <(fast atom bombardment », un jet d’atomes ou d’ions accélérés est projeté sur une cible constituée par
une solution de l’échantillon dans un liquide visqueux. En frappant la surface de
la cible, les atomes transmettent leur énergie cinétique aux molécules de l’échantillon. Beaucoup sont projetées hors de la cible dans le vide de la source d’ions et
ionisées en proportion notable. De cette façon, les ions en phase gazeuse sont produits sans volatilisation préalable de l’échantillon. TI se forme des ions positifs
[M + HI+, [M + cation]’ et négatifs [M - HI-, surtout, et aussi, [M + anion]-, selon
la nature de l’échantillon et de la matrice visqueuse. On emploie de préférence le
glycérol avec les molécules polaires, tels que les oligosaccharides et les glycopeptides natifs, mais pour les composés hydrophobes comme les glycosphingolipides, qui ont tendance à s’agglomérer dans les solvants polaires, on préfère le
1-thioglycérol CH,SH - CHOH - CH,OH. I1 est utile d’acidifier le mélange avec
des traces d’HCI dilué. L‘addition d’acétate de sodium entraîne la formation
d’ions [M + Na]+. L‘addition de thiocyanate d’ammonium à certains oligosaccharides perméthylés entraîne la formation d’ions [M + NHJ et [M + SCNI-.
Seules les molécules présentes à la surface de la matrice sont ionisées par le jet
atomique et il faut éviter la présence d’impuretés plus tensio-actives qui les en
chasseraient.
On observe des pics intenses d’ions pseudo-monomoléculaires et des pics de
fragments. On emploie les sucres non dérivés pour déterminer M, mais il est souvent utile de préparer d’abord un dérivé par perméthylation (voir le paragraphe
9.3.3) ou peracétylation (traitement par un mélange d’acide acétique et d’anhydride trifluoracétique, 2 :1, v/v, 9 mn à température ambiante). Les quantités
d’échantillon nécessaires à l’investigation sont 1-9 pg de sucre libre, ou O, 1-5pg
de dérivé. Trois types de sucre donnent des pics au-dessus de M 4000 : les polysaccharides perméthylés, les glycosphingolipides perméthylés et les formes naturelles acylées des polysaccharides mycobactériens.
Nous donnerons deux modes de clivage, désignés comme dans la référenceL6]
(Fig. 9.5). Dans le mode A, le principal, la charge est retenue sur le fragment du
côté de l’extrémité non réductrice. Dans le mode B, la charge est retenue du côté
de l’extrémité réductrice. Avec les oligosaccharides dérivés, MNPQR, où M est le
résidu monosaccharidique du côté non réducteur, on observe principalement la
voie A selon l’équation (9.2).