Détermination des séquences par les méthodes chimiques
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9.3 DÉTERMINATION DES SÉQUENCES
PAR LES METHODES CHIMIQUES
9.3.1 Hydrolyse acide
La première question concerne la nature et les proportions relatives des monosaccharides constitutifs. On y arrive en principe par hydrolyse acide14] mais, dans
la pratique, il faut l’appliquer avec discernement car il y a un certain nombre de
cas d’espèce importants. On emploie les acides chlorhydrique, sulfurique et trifluoracétique, dont les solutions N ont respectivement les pH 0,l - 0,3 - 0,7.
Lorsque l’hydrolyse libère des monosaccharides fragiles en milieu acide, il y a un
équilibre délicat à maintenir entre les risques d’hydrolyse incomplète et de destruction partielle du produit d’hydrolyse. Les sucres fragiles sont les pentoses, les
désoxysucres, les acides uroniques et aldoniques. Lorsque l’acide sialique est
maintenu 30 mn à 90” dans HCl0,Ol M, il y a 20 % de décomposition. Avec les
polysaccharides neutres, on peut limiter la décomposition à moins de 9 %. Les
groupements acétylés des acétamides sont hydrolysés et on obtient les amino
sucres protonés, qui sont relativement stables.
Chydrolyse par l’acide chlorhydrique méthanolique, qui conduit aux méthyl
glycosides serait moins destructrice, mais, dans le pire des cas, un monosaccharide peut se retrouver dans le << méthanolysat >> sous quatre formes chimiques différentes, les quatre méthyl glycosides. L‘acétolyse, c’est-à-dire la dégradation par
un mélange d’anhydride acétique et d’acide sulfurique transforme la cellulose en
octoacétate du disaccharide P-D-Glcp-( 1+4)-Glc, mais c’est une réaction préparative plutôt qu’une méthode d’analyse. L‘acétolyse est parfois préconisée comme
étape additionnelle dans les opérations analytiques.
9.3.2 Hydrolyse enzymatique
Nous avons déjà parlé, au paragraphe 3.5.2 des enzymes glycosidases. Les exoglycosidases détachent un élément monosaccharidique situé à une extrémité non
réductrice (il y en a souvent plusieurs car les chaînes sont ramifiées). Elles sont
nommées en fonction de l’unité qu’elles détachent, neuraminidase (d’un autre
nom de l’acide sialique, acide N-acétylneuraminique), fucosidase, galactosidase,
mannosidases et aminohexosidases, et sont normalement spécifiques pour les
configurations a ou p. En principe, elles permettent donc une dégradation résidu
par résidu à partir de l’extrémité non réductrice et peuvent être employées en
conjonction avec les méthodes par méthylation décrites ci-dessous.
Nous n’avons pas décrit au chapitre 3 les endoglycosidases. Elles catalysent
l’hydrolyse d’une liaison glycosidique au milieu d’une chaîne et sont spécifiques
de la configuration des deux sucres qu’elles ~éparent‘~]. La endo-2-acétamido-2déoxy-fi-D-glucosidase coupe en son milieu la séquence dite << chitobiose >>
)-P-D-GlcNAcp-( 1 +4)-P-D-GlcNAcp-( présente à l’extrémité réductrice de certaines glycoprotéines. Un autre enzyme, une endo-P-D-galactosidase coupe spécifiquement la liaison entre galactose et N-acétylglucosamine dans la séquence
fort commune -+3)-P-D-Galp-( 1-+4)-P-D-Glc NAc p (I+.
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9.3 DÉTERMINATION DES SÉQUENCES
PAR LES METHODES CHIMIQUES
9.3.1 Hydrolyse acide
La première question concerne la nature et les proportions relatives des monosaccharides constitutifs. On y arrive en principe par hydrolyse acide14] mais, dans
la pratique, il faut l’appliquer avec discernement car il y a un certain nombre de
cas d’espèce importants. On emploie les acides chlorhydrique, sulfurique et trifluoracétique, dont les solutions N ont respectivement les pH 0,l - 0,3 - 0,7.
Lorsque l’hydrolyse libère des monosaccharides fragiles en milieu acide, il y a un
équilibre délicat à maintenir entre les risques d’hydrolyse incomplète et de destruction partielle du produit d’hydrolyse. Les sucres fragiles sont les pentoses, les
désoxysucres, les acides uroniques et aldoniques. Lorsque l’acide sialique est
maintenu 30 mn à 90” dans HCl0,Ol M, il y a 20 % de décomposition. Avec les
polysaccharides neutres, on peut limiter la décomposition à moins de 9 %. Les
groupements acétylés des acétamides sont hydrolysés et on obtient les amino
sucres protonés, qui sont relativement stables.
Chydrolyse par l’acide chlorhydrique méthanolique, qui conduit aux méthyl
glycosides serait moins destructrice, mais, dans le pire des cas, un monosaccharide peut se retrouver dans le << méthanolysat >> sous quatre formes chimiques différentes, les quatre méthyl glycosides. L‘acétolyse, c’est-à-dire la dégradation par
un mélange d’anhydride acétique et d’acide sulfurique transforme la cellulose en
octoacétate du disaccharide P-D-Glcp-( 1+4)-Glc, mais c’est une réaction préparative plutôt qu’une méthode d’analyse. L‘acétolyse est parfois préconisée comme
étape additionnelle dans les opérations analytiques.
9.3.2 Hydrolyse enzymatique
Nous avons déjà parlé, au paragraphe 3.5.2 des enzymes glycosidases. Les exoglycosidases détachent un élément monosaccharidique situé à une extrémité non
réductrice (il y en a souvent plusieurs car les chaînes sont ramifiées). Elles sont
nommées en fonction de l’unité qu’elles détachent, neuraminidase (d’un autre
nom de l’acide sialique, acide N-acétylneuraminique), fucosidase, galactosidase,
mannosidases et aminohexosidases, et sont normalement spécifiques pour les
configurations a ou p. En principe, elles permettent donc une dégradation résidu
par résidu à partir de l’extrémité non réductrice et peuvent être employées en
conjonction avec les méthodes par méthylation décrites ci-dessous.
Nous n’avons pas décrit au chapitre 3 les endoglycosidases. Elles catalysent
l’hydrolyse d’une liaison glycosidique au milieu d’une chaîne et sont spécifiques
de la configuration des deux sucres qu’elles ~éparent‘~]. La endo-2-acétamido-2déoxy-fi-D-glucosidase coupe en son milieu la séquence dite << chitobiose >>
)-P-D-GlcNAcp-( 1 +4)-P-D-GlcNAcp-( présente à l’extrémité réductrice de certaines glycoprotéines. Un autre enzyme, une endo-P-D-galactosidase coupe spécifiquement la liaison entre galactose et N-acétylglucosamine dans la séquence
fort commune -+3)-P-D-Galp-( 1-+4)-P-D-Glc NAc p (I+.